バッファー

出典:米国ジョンズ・ホプキンス大学(米国メリーランド州)のSmaa Koraym

1. 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7Expand

   この実験の最初の部分では、pH 7.0 で緩衝したリン酸ナトリウム溶液を調製します。リン酸一ナトリウムは、共役塩基であるリン酸二ナトリウムを持つ弱酸です。未調整のリン酸ナトリウム溶液は、通常、pHが約4〜6です。

   バッファーは、pKa(リン酸一ナトリウムに対して6.8〜7.2)の近くで最も効果的です。したがって、NaOHを使用して、バッファー平衡の全体的な組成を変更せずに、平衡を共役塩基に押し付けます。

   • 実験を開始する前に、50 mM溶液を200 mL作るために必要なリン酸ナトリウムの質量を計算してください。

     表1:50 mM NaH₂PO₄バッファー、pH 7.0の調製

     NaH2PO4 = 119.98 g/mol のモル質量
     溶液量(mL)	200
     モル濃度(mM)	50
     NaHのモル2PO4 (mol)
     必要質量(mg)
     1 M NaOH (mL) の初期容量
     1 M NaOH (mL) の最終容量
     NaOH使用量(mL)
     必要な脱イオン水の量 (mL)

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     。
   • まず、白衣、防滴安全メガネ、手袋など、必要な個人用保護具を着用してください。手記： ラボのこのセクションでは、腐食性で有毒なNaOHを使用しています。NaOHを注いで輸送する場合は注意してください。
   • 250mLのプラスチック洗浄ボトルに脱イオン水を入れます。
   • 2つの100mLビーカーにラベルを付けます。1つは中性水系廃棄物用、もう1つは塩基性水性廃棄物用です。
   • 付属のバッファーを使用してpHメーターを校正します。完了したら、プローブをストレージソリューションに保管します。
   • 風袋計量紙を使用し、きれいなヘラを使用して、計算に従って必要なリン酸ナトリウムの量を測定します。リン酸ナトリウムの正確な量をラボノートに記録します。手記： リン酸一ナトリウムは空気から水分を吸収するため、正確な測定値を得るために迅速に作業し、使い終わったら容器をしっかりと閉じてください。
   • リン酸ナトリウムを400mLのビーカーに入れ、実験室のワイプでヘラを掃除します。計量用紙と実験室用ワイプを捨ててから、ドラフトに戻ってください。
   • メスシリンダーを使用して、175mLの脱イオン水を測定します。リン酸ナトリウムのビーカーに水を注ぎ、マグネチックスターバーを追加します。
   • 塩が完全に溶解し、溶液が均一になるまで溶液を攪拌します。通常、これには 2 分から 3 分かかります。
   • 15mLの脱イオン水を測定し、ビーカーに注ぎます。溶液が再び均一になるまで攪拌を続けます(約1〜2分)。攪拌モーターをオフにしてください。
   • pHプローブを脱イオン水ですすぎ、攪拌子の上にあるセンサーで溶液にクランプします。
   • 10 mLメスシリンダーとウォッチグラスを分注フードに持ってきて、10 mLの1 M NaOHを測定します。メスシリンダー内の正確な体積に注意してください。
   • NaOHを時計のガラスで覆い、慎重にドラフトに持っていきます。
   • リン酸一ナトリウム溶液の攪拌を再開します。pH測定値を監視しながら、使い捨てピペットを使用して、NaOHを攪拌溶液にゆっくりと滴下します。緩衝液のpHが7.0に達したら、ピペットに残っているNaOHをメスシリンダーに戻します。
   • バッファーに追加したNaOHの量を計算します。その容量を 10 mL から差し引いて、総溶液容量が 200 mL に達するためにバッファーに追加する必要がある脱イオン水の量を決定します。
   • 別の10mLメスシリンダーで脱イオン水を測定し、それを攪拌液に加えてバッファーの作成を完了します。
   • pHセンサーを脱イオン水ですすぎ、保存溶液で満たされたキャップで覆い、プローブのプラグを抜くかオフにします。
   • 250 mLのポリエチレンボトルを「50 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0」と表示してください。溶液からマグネチックスターバーを取り出します。
   • 漏斗を使用して、ラベル付きのボトルに緩衝液を注ぎ、しっかりと蓋をします。
2. 自由で束縛された中性赤の吸収分光法Expand

   バッファーは、特定のpH値で化合物を評価するために使用できます。このセクションでは、さまざまなバッファでインジケーターニュートラルレッドの吸光度スペクトルを記録します。ニュートラルレッドのプロトン化型は赤、脱プロトン型は黄橙色で、それぞれ緑と青紫の光を吸収します。したがって、酸性形態と塩基性形態は異なる吸収波長を有する。タンパク質の結合は、中性赤の特性を変化させ、その吸光度とpKaの両方を変化させます。

   遊離中性赤色の吸光度スペクトルをいくつかのpH値で測定した後、溶液にリボフラビン結合タンパク質(RP)を添加し、吸光度を再度測定します。吸光度強度は濃度に関係しているため、ラボ後にスペクトルを使用して、自由赤と結合した中性赤のpKaを決定します。

   • 実験ノートに次の表を描きます。キュベットに1から10までの番号を付け、使用する9つの緩衝液のpH値をリストアップします。10番目のキュベットは脱イオン水ブランクになります。 手記： 常にキュベットをテクスチャーのある側面で保持し、キュベットを分光光度計に入れる直前に透明な側面を拭いてください。透明な面を分光光度計の光線に合わせることを忘れないでください。

     表2:遊離および結合した中性赤の吸光度

     キュベット#	バッファーpH	絶対 λmax(Free NRH+)	Abs. at λmax (Bound NRH)
     1	5.0
     2	5.5
     3	6.0
     4	6.5
     5	7.0
     6	7.5
     7	8.0
     8	8.5
     9	11
     10	空白

     ここをクリックして表 2 をダウンロード
   • 10個の1.5mLキュベットとキャップを用意し、実験ノートの表と一致するようにキャップ1から10にラベルを付けます。
   • 25mLビーカーに「DIH2O」のラベルを付け、脱イオン水で満たします。
   • 中性の水性廃棄物を排水溝に流し、ビーカーを「水性緩衝液」とラベル付けし直します。
   • 使用済みのマイクロピペットチップ用の400mLビーカーにラベルを付けます。
   • 1mLのマイクロピペットにチップを取り付け、それを使用して1000μLの脱イオン水をキュベット10に分注します。これがあなたの溶剤ブランクです。
   • 925 μLのpH 7.0リン酸ナトリウム緩衝液をキュベット5に入れます。
   • 残りの空のキュベットをバッファテーブルに持ってきます。ラボノートの表に従って、ラベル付きのマイクロピペットを使用して、各バッファー925μLを適切なキュベットに分注します。異なるバッファーに同じピペットチップを使用しないように注意してください。
   • 完了したら、バッファをワークベンチに戻してください。そこで、200μLのマイクロピペットをセットして75μLを分注し、マイクロピペットにチップを取り付けます。
   • 9つのバッファーキュベットのそれぞれに75μLの中性赤を分注します。各キュベットを数回反転させて、溶液を完全に混合します。手記： ピペットチップがバッファーに接触している場合は、元に戻してください。
   • すべてのバッファーにニュートラルレッドを混ぜたら、写真を撮ったり、溶液の色を書き留め
     たりしてください。
   • ハンドヘルド分光測色計の電源を入れ、光源がウォームアップするのを待ちます。準備ができたら、新しい実験を作成して、遊離中性赤の吸光度と波長を測定します。
   • 脱イオン水のキュベットを挿入し、脱イオン水のスペクトルを取得します。溶剤の背景または空白として設定します。
   • 次に、ブランクを取り外し、プロトン化中性赤の濃度が最も高い最も低いpH緩衝液に中性赤のキュベットを挿入します。
   • スペクトルを取得します。これにより、1つの強いピークが表示されます。このピークの最高点または最大値に対応する波長を特定します。この波長をラボノートにラムダマックスとして記録し、プロトン化フリーニュートラルレッドにします。
   • データを保存し、キュベットを取り外します。吸光度をノートに記録し、同じ手順でキュベット2〜9のスペクトルを収集します。
   • ラボノートにアイソスベスト点の波長を記録します。これは、すべてのスペクトルが単一の波長で交差する場所です。その時点でスペクトルが交差しない場合は、キュベットを空にして清掃し、新しいサンプルを準備して、再試行してください。
   • 9つのキュベットすべてのスペクトルの収集が終了したら、データを保存してエクスポートします。
   • 新しい実験を作成して、バインドされたニュートラルレッドの吸光度と波長を測定します。
   • 新しいチップを200μLのマイクロピペットに取り付け、ブランクを含む各キュベットに75μLのリボフラビン結合タンパク質溶液を追加します。先端を取り出し、キュベットキャップを固定し、キュベットを数回反転させて溶液を混合します。
   • キュベット10を分光光度計に挿入し、それを溶媒ブランクとして設定します。
   • 最も低いpHサンプルのスペクトルを取得し、最も強いピークの最大値に対応する波長を特定します。それをプロトン化結合ニュートラルレッドのラムダマックスとしてラボノートに記録します。
   • キュベット2〜9のスペクトルを、無料の中性赤サンプルの場合と同じ方法で取得します。プロトン化結合ニュートラルレッドのラムダマックスでの強度を、等値化点の波長とともにテーブルに記録します。
   • 完了したら、データを保存し、後で分析するためにエクスポートし、分光光度計をシャットダウンします。
   • すべての機器を片付け、使用済みのピペットチップは承認された廃棄物容器またはゴミ箱に捨ててください。
   • キュベットを水緩衝廃棄物ビーカーに空にし、脱イオン水でキュベットをビーカーにすすぎます。
   • 余分なNaOHを塩基性廃棄物に空にし、メスシリンダーを水ですすいでください。
   • 塩基性水系廃棄物を、他の水性廃棄物と一緒に大量の水道水で排水溝に流します。
   • ガラス器具、キュベットキャップ、攪拌棒をラボの標準的な手順に従って洗ってください。湿らせたペーパータオルで作業面を清掃し、使用済みのペーパータオルやラボ用ワイプはラボのゴミ箱に捨てます。
3. >ResultsExpand

   次に、吸光度データを分析して、ニュートラルレッドのpKaを決定しましょう。

   表3:ニュートラルレッドpKaの測定

   の

   	無料のNRH+	バウンドNRH+
   λ MAX (nm)
   ΔA電流 (nm)
   中点 (nm)
   pKa

   ここをクリックして表3をダウンロード

   • 両方の強度データのセットを、y軸のラムダmaxとx軸のpHの吸光度でプロットし、ポイントを滑らかな線で結合します。
   • 各データ系列の開始吸光度と終了吸光度強度の差を計算します。
   • 各系列の開始吸光度と終了吸光度の中間、または吸光度の中点を決定します。
   • 各行で中点が発生する場所を見つけ、その点のpH値を特定します。これらのpH値は、遊離および結合した中性赤のpKaです。
   • ここでは、遊離中性赤と結合中性赤の間でpKaが約1増加していることが分かります。これは、有界プロトン化中性赤が遊離プロトン化中性赤よりも一桁弱い酸であることを示しています。

この実験の最初の部分では、pH 7.0 で緩衝したリン酸ナトリウム溶液を調製します。リン酸一ナトリウムは、共役塩基リン酸二ナトリウムと共役する弱酸です。未調整のリン酸ナトリウム溶液のpHは通常、約4〜6です。

バッファーは、pKa(リン酸一ナトリウムに対して6.8〜7.2)の近くで最も効果的です。したがって、水酸化ナトリウムを使用して、バッファー平衡の全体的な組成を変えることなく、平衡を共役塩基に押し込みます。ラボを開始する前に、200ミリリットルの50ミリモル溶液を作るために必要なリン酸ナトリウムの質量を計算してください。

ラボのこのセクションでは、腐食性で有毒な水酸化ナトリウムを使用しています。水酸化ナトリウムを注いで輸送するときは注意してください。それでは、始めましょう。

まず、白衣、飛沫防止保護メガネ、ニトリル手袋を着用します。次に、250ミリリットルのプラスチック製洗浄ボトルに脱イオン水を入れます。2つの100ミリリットルのビーカーに、それぞれ中性および塩基性の水性廃棄物にラベルを付けます。

次に、付属のバッファーを使用してpHメーターを校正します。完了したら、プローブをストレージソリューションに保管します。次に、400ミリリットルのビーカーを分析バランス領域に持ってきて、必要なリン酸一ナトリウムを取得します。

一枚の計量紙を風袋引きし、きれいなヘラを使用して、計算に従って必要なリン酸ナトリウムの量を測定します。リン酸一ナトリウムは空気中の水分を吸収するため、正確な測定値を得るために迅速に作業し、使い終わったら容器をしっかりと閉じてください。測定したリン酸ナトリウムの正確な量をラボノートに記録します。

次に、リン酸ナトリウムをビーカーに入れ、実験室のワイプでへらを掃除します。計量用紙と実験室用ワイプを捨ててから、ドラフトに戻ってください。次に、メスシリンダーを使用して、175ミリリットルの脱イオン水を測定します。

リン酸ナトリウムのビーカーに水を注ぎ、マグネチックスターバーを追加します。塩が完全に溶解し、溶液が均一になるまで、攪拌板で溶液を攪拌します。これには通常2〜3分かかります。

次に、メスシリンダーで15ミリリットルの脱イオン水を測定します。脱イオン水をビーカーに注ぎ、溶液が再び均一になるまで攪拌を続けます(通常は1〜2分かかります)。次に、攪拌モーターをオフにします。

pHプローブを脱イオン水ですすぎ、攪拌子の上にあるセンサーで溶液にクランプします。次に、10ミリリットルのメスシリンダーとウォッチグラスをディスペンシングフードに持ってきて、10ミリリットルの1モル水酸化ナトリウムを測定します。水酸化ナトリウムを時計のガラスで覆い、慎重にドラフトに持っていきます。

メスシリンダー内の正確な体積に注意してください。その後、リン酸一ナトリウム溶液の攪拌を再開します。pH測定値を監視しながら、使い捨てピペットを使用して、攪拌液に水酸化ナトリウムを滴下しながらゆっくりと加えます。

緩衝液のpHが7.0に達したら、ピペットに残っている水酸化ナトリウムをメスシリンダーに戻します。次に、メスシリンダーの初期体積と最終体積から、追加した水酸化ナトリウムの体積を計算します。その容量を10ミリリットルから差し引いて、総溶液量が200ミリリットルに達するためにバッファーに追加する必要がある脱イオン水の量を決定します。

必要な脱イオン水を別の10ミリリットルメスシリンダーで測定し、攪拌液に加えてバッファーの作成を完了します。pHセンサーを脱イオン水ですすぎ、保存溶液で満たされたキャップで覆い、プローブのプラグを抜くか電源を切ります。その後、250ミリリットルのポリエチレンボトルに50ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0'としてラベルを付けます鉗子を使用して、溶液からマグネチックスターバーを取り出します。

次に、ボトルの口に漏斗を置き、緩衝液をボトルに注ぎます。漏斗を取り外し、ボトルをしっかりとキャップします。これで、吸収分光法のセクションに進む準備が整いました。

バッファーは、特定のpH値で化合物を評価するために使用できます。このセクションでは、さまざまなバッファでインジケーターニュートラルレッドの吸光度スペクトルを記録します。ニュートラルレッドのプロトン化型は赤、脱プロトン型は黄橙色で、それぞれ緑と青紫の光を吸収します。

したがって、酸性形態と塩基性形態は異なる吸収波長を有する。タンパク質の結合は、中性赤の特性を変化させ、その吸光度とpKaの両方を変化させます。遊離中性赤色の吸光度スペクトルをいくつかのpH値で測定した後、溶液にリボフラビン結合タンパク質(RP)を添加し、吸光度を再度測定します。

吸光度強度は濃度に関係しているため、ラボ後にスペクトルを使用して、自由赤と結合した中性赤のpKaを決定します。このセクションを開始する前に、ラボノートに表を描き、キュベット番号、バッファーpH、遊離プロトン化中性赤のラムダ最大での吸光度、結合したプロトン化中性赤のラムダ最大での吸光度をリストアップします。キュベットに1から10までの番号を付け、使用する9つの緩衝液のpH値をリストアップします。

10番目のキュベットは脱イオン水ブランクになります。常にキュベットをテクスチャーのある側面で保持し、キュベットを分光光度計に入れる直前に透明な側面を拭いてください。透明な面を分光光度計の光線に合わせることを忘れないでください。

それでは、始めましょう。1.5ミリリットルのキュベットとキャップを10個用意し、実験ノートの表に合わせてキャップに1から10のラベルを付けます。25ミリリットルのビーカーにDIH2O'のラベルを付け、脱イオン水で満たします。

次に、中性の水性廃棄物を排水溝に流し、ビーカーに水性緩衝液として再ラベルを付けます'また、使用済みのマイクロピペットチップ用の400ミリリットルのビーカーにラベルを付けます。次に、1ミリリットルのマイクロピペットにチップを取り付け、それを使用して1000マイクロリットルの脱イオン水をキュベット10に分注します。これがあなたの溶剤ブランクになります。

次に、チップを取り出し、マイクロピペットを925マイクロリットルを分注するように設定し、新しいチップを取り付けます。925マイクロリットルのpH 7.0リン酸ナトリウム緩衝液をキュベット5に入れます。先端を取り出し、キュベットにキャップをします。

次に、残りの空のキュベットをバッファーテーブルに持ってきます。ラボノートの表に従って、ラベル付きのマイクロピペットを使用して、各バッファーの925マイクロリットルを適切なキュベットに分注します。異なるバッファーに同じピペットチップを使用しないように注意してください。

完了したら、バッファをワークベンチに戻します。そこで、200マイクロリットルのマイクロピペットをセットして75マイクロリットルを分注し、マイクロピペットにチップを取り付けます。次に、他の学生グループと共有できる中性の赤い溶液のバイアルまたはチューブを入手します。

75マイクロリットルの中性赤を9つのバッファーキュベットのそれぞれに分配します。ピペットチップがバッファーに接触している場合は、元に戻してください。ピペットチップを取り出し、終了したらキュベットにキャップをします。

次に、各キュベットを数回反転させて、溶液を完全に混合します。すべてのバッファーにニュートラルレッドを混ぜたら、写真を撮るか、溶液の色を書き留めます。次に、ハンドヘルド分光光度計の電源を入れ、光源が温まるのを待ちます。

準備ができたら、新しい実験を作成して、遊離中性赤の吸光度と波長を測定します。次に、脱イオン水のキュベットを挿入します。脱イオン水のスペクトルを取得し、それを溶媒の背景またはブランクとして設定します。

次に、分光光度計からブランクを取り外し、プロトン化中性赤の濃度が最も高い最も低いpH緩衝液に中性赤のキュベットを挿入します。スペクトルを取得し、1つの強いピークを示す必要があります。このピークの最高点または最大値に対応する波長を特定します。

この波長をラボノートにラムダマックスとして記録し、プロトン化フリーニュートラルレッドにします。データを保存し、キュベットを取り外します。吸光度をノートブックに記録し、同じ手順でキュベット2からキュベット9のスペクトルを収集します。

スペクトルはすべて、アイソスベスト点と呼ばれる 1 つの点で交差する必要があります。この点の波長を実験ノートに記録します。その時点でスペクトルが交差しない場合は、キュベットを空にして清掃し、新しいサンプルを準備して、再試行してください。

9 つのキュベットすべてのスペクトルの収集が完了したら、データを保存してエクスポートします。次に、結合された中性赤の吸光度と波長を測定する新しい実験を作成します。新しいチップを200マイクロリットルのマイクロピペットに取り付け、リボフラビン結合タンパク質の共有容器を入手します。

ブランクを含む各キュベットに75マイクロリットルのリボフラビン結合タンパク質溶液を追加します。.先端を取り出し、キュベットキャップを固定し、キュベットを数回反転させて溶液を混合します。次に、キュベット10を分光光度計に挿入し、溶媒ブランクとして設定します。

次に、最も低いpHサンプルのスペクトルを取得し、最も強いピークの最大値に対応する波長を特定します。それをプロトン化結合ニュートラルレッドのラムダマックスとしてラボノートに記録します。その後、キュベット 2 から 9 のスペクトルを、遊離中性赤サンプルの場合と同じ方法で取得します。

プロトン化結合ニュートラルレッドのラムダマックスでの強度を、等値化点の波長とともにテーブルに記録します。完了したら、データを保存し、後で分析するためにエクスポートして、分光光度計をシャットダウンします。マイクロピペット、チップボックス、pHメーター、分光光度計は片付けてください。

使用済みのピペットチップは、承認された廃棄物容器またはゴミ箱に捨ててください。次に、キュベットを水性緩衝廃棄物ビーカーに空にし、キュベットを脱イオン水でビーカーにすすぎます。ドラフトで、余分な水酸化ナトリウムを塩基性廃棄物に空にし、メスシリンダーを水ですすいでください。

塩基性水性廃棄物は、他の水性廃棄物と一緒に大量の水道水で排水溝に流します。ガラス器具、キュベットキャップ、攪拌棒をラボの標準的な手順に従って洗浄します。最後に、湿らせたペーパータオルで作業面を清掃し、使用済みのペーパータオルやラボ用ワイプはラボのゴミ箱に捨てます。

次に、吸光度データを分析して、ニュートラルレッドのpKaを決定しましょう。まず、両方の強度データのセットを、Y 軸のラムダ マックスの吸光度強度と X 軸の pH でプロットし、点を滑らかな線で結合します。次に、データ系列ごとに、開始吸光度強度と終了吸光度強度の差を計算します。

これを使用して、各系列の開始吸光度と終了吸光度の中間、または吸光度の中間点の吸光度を計算します。次に、各ラインのどこに中点があるかを見つけ、そのポイントのpH値を特定します。これらのpH値は、遊離および結合した中性赤のpKaです。

ここでは、遊離中性赤と結合中性赤の間でpKaが約1増加していることがわかり、結合したプロトン化中性赤は遊離プロトン化中性赤よりも一桁弱い酸であることを示しています。