薄層クロマトグラフィー

出典:Lara Al Hariri氏とAhmed Basabrain氏(米国マサチューセッツ州アマースト校

1. 移動相組成が化合物分離に及ぼす影響Expand

   ラボのこのセクションでは、TLCを使用して、純粋なヘキサンと60%ヘキサンおよび40%酢酸エチルの混合物がフェノール、安息香酸、ブチルフェニルエーテルをどれだけ分離できるかを、化合物が各溶媒中を移動した距離を測定することにより

   比較します。
   • ラボを開始する前に、白衣、安全メガネ、ニトリル手袋を着用してください。注:ヘキサンと酢酸エチルはどちらも揮発性で、毒性があり、可燃性であるため、常にドラフト内で使用してください。ヘキサンと酢酸エチルが数分以内にニトリル手袋に浸透するため、手袋に溶剤が付着した場合は手袋を交換してください。
   • さあ、ペーパータオルを手に入れてベンチトップに置きます。プレートの一番端にあるピンセットを使用して、TLCプレートを慎重に持ち上げます。 手記： TLCプレートは、シリカゲルの損傷や汚染を防ぐために、常にピンセットで端または最上部に保持してください。
   • シリカゲルの欠けや傷を探し、必要に応じて新しいプレートを入手してください。片方の端だけに少し欠けがあっても、それが上部になる可能性があるため、問題ありません。
   • ペーパータオルの上にプレートを置き、その隣にメートル法の定規を置きます。グラファイトペンシルを使用して、プレートの上部から~1cmのシリカゲルに小さな印をそっと描きます。マークの上のプレートに「100」と書きます。
   • 次に、プレートの底面から1cm上の両側にそっと印を付けます。下部のマークの間に直線を慎重になぞり、スタートラインを作ります。
   • 次に、プレートの側面から少なくとも0.5cm離れた外側のマークを使用して、等間隔の3つの小さなマークをスタートラインに追加します。手記：ここではシリカゲルが傷んでいないことが大切ですので、鉛筆で引っ掻いてしまった場合は新しいお皿を用意しましょう。
   • さて、ラボノートでTLCプレートの輪郭をトレースし、プレートのマークを正確にコピーします。3つのマークに「フェノール」、「安息香酸」、「ブチルフェニルエーテル」のラベルを付けます。プレート自体のマークにラベルを付けることもできます。
   • 同様に「60/40」とラベル付けされた2番目のTLCプレートを準備します。次に、ラベル付けされたプレートを共通のベンチに持って行き、エタノール中のフェノール、安息香酸、およびブチルフェニルエーテルの1 mg / mL溶液を見つけます。
   • きれいな毛細管を3つの溶液のいずれかに浸します。キャピラリーをスタートラインとそのコンパウンドのマークとの間の交差点に対して短く軽くたたきます。化合物ごとに2回スポットする必要があります。
   • 同じキャピラリーを使用して、2番目のTLCプレートで同じ溶液を見つけます。スポットの直径は2mm以下でなければなりません。次に、キャピラリーを廃棄し、バイアルを閉じます。
   • きれいな毛細血管を使用して、同じ方法でプレート上の他の2つの溶液を見つけます。溶液を交差汚染しないように注意してください。注:スポットが非常に薄いか非常に小さい場合は、スポットが乾くのを待ってから、ドライスポットの上に同じ溶液を見つけます。スポットがまだ濡れている場合、毛細管現象により幅が広くなりすぎて薄くなる可能性があります。
   • 各プレートに3つのスポットを作成したら、キャピラリーを捨ててプレートをフードに戻します。プレートが乾くまで平らに置いておきます。
   • 次に、50mLの瓶に「100%ヘキサン」のラベルを貼り、瓶とそのキャップ、および10mLのメスシリンダーを溶媒フードに持って行きます。
   • メスシリンダーで2〜3mLの純粋なヘキサンを測定し、それを瓶に注ぎ、0.62〜0.7cmの深さまで満たします。
   • 2つ目の50mLジャーに「60%ヘキサン、40%酢酸エチル」とラベルを貼り、それときれいなメスシリンダーを溶剤フードに持って行きます。2/3混合物の60〜40mLを瓶に測定し、ドラフトに戻します。
   • 瓶の隣にプレートを立てて、溶媒とスポットの相対位置を比較します。溶媒レベルは、各プレートのスポットより下にある必要があります。
   • 次に、濾紙を3枚用意し、各瓶の壁に濾紙を立てて置き、瓶にしっかりと蓋をします。
   • マークの上に各プレートをイニシャルを付けて、後で識別できるようにします。瓶の中の濾紙が溶剤で飽和していること、およびプレートの斑点が完全に乾いていることを確認してください。
   • 次に、100%ヘキサンジャーを開け、ピンセットを使用して100プレートをジャーにそっと置き、プレートが溶媒に入るときにプレートを溶媒表面と同じ高さに保ちます。プレートがぶつからないように注意しながら、瓶をしっかりと閉じます。
   • 溶媒がプレートを上る間、瓶を動かしたままにしておきます。純粋なヘキサンでの現像には通常約7〜10分かかります。プレートに注意して、溶剤が上部に到達しないように注意してください。
   • 純粋なヘキサン溶媒の前面がプレートの上部から約1cmのところにある場合、ピンセットを使用して取り出します。シリカゲルを上に向けてペーパータオルの上に置き、プレート全体に線と鉛筆で溶剤の前面にすばやく印を付けます。溶媒が蒸発するので、プレートを平らにしておきます。
   • 同様に、もう一方のプレートを60/40溶離液に入れます。60/40プレートの溶剤前面が上から約1cmになるまで待ってから、それを取り出して、同じように溶剤前面にすばやくマークを付けます。
   • 100%ヘキサンプレートが完全に乾いたら、ピンセットで持ち上げ、鉛筆と鉛筆を共用ベンチのUVランプに持っていきます。
   • プレートをランプの下に置き、UVライトで照らします。プレートは、シリカゲル層の蛍光マーカーにより緑色に光ります。ダークスポットは化合物です。
   • 鉛筆のすべてのスポットの輪郭を慎重に描きます。ただし、あまり遠くに移動していない場合でも。
   • 次に、ランプを消して、プレートをヨウ素発生フードに持っていきます。ヨウ素チャンバーを開きます。ピンセットを使用してプレートをヨウ素チャンバーにそっと直立させて置き、チャンバーを再度覆います。
   • ヨウ素蒸気がスポットに留まるまで3〜4分待ちます。次に、ピンセットでプレートを取り出し、チャンバーを閉じて、プレート上の茶色と黄色の斑点の輪郭を描きます。これらのスポットは色あせてしまうので、すぐに印をつけてください。
   • 乾燥した60/40プレートをUV光の下で視覚化し、次にヨウ素蒸気を同じように視覚化します。 手記： 副反応を避けるために、プレートをヨウ素にさらす前に、必ずUV光の下でプレートを確認してください。
   • 次に、スポットと溶媒の前面をラボノートのプレートの対応する図面に正確にコピーします。各プレートについて、スタートラインに対する溶媒前面の高さを測定し、記録します。
   • 最後に、各スポットの中心からスタートラインまでの距離を測定し、それをラボノートに記録します。これで、ラボの次の部分に進むことができます。
2. 不明な化合物の同定Expand

   ラボの後半では、TLCを使用して、未知の鎮痛薬に何が含まれているかを調べます。アスピリン、カフェイン、アセトアミノフェンなどの化合物を1つ以上含んでいる可能性があります。これらの化合物は極性が高いため、溶離液として90%酢酸エチルと10%ヘキサンの既製の混合物を使用します。

   3つの参照化合物と未知化合物をすべて同じプレート上で分析します。後で、参照化合物のRf値を使用して未知化合物を特定します。まず、分析を開始する前に、どの未知の材料が割り当てられたかを再確認してください。

   • さあ、フードにきれいなペーパータオルを敷き、新しいTLCプレートを手に入れましょう。トップマークとスタートラインは、これまでと同じように準備します。プレート上に4つの等間隔のティックを作成し、外側のマークが端から少なくとも0.5cm離れていることを確認します。
   • ラボノートにプレートの正確なコピーを描き、目盛りに「aspirin」、「acetaminophen」、「caffeine」、「unknown」のラベルを付けます。
   • さあ、お皿を共用ベンチに持って行きましょう。アスピリン、アセトアミノフェン、カフェイン、および各溶液のきれいな毛細管を使用して適切なマークに割り当てられた未知の溶液を見つけます。手記： 未知の溶液を見つけているときは、未知の物質からの不溶性物質でキャピラリーが詰まらないように、キャピラリーを溶液バイアルに深く浸さないでください。
   • プレートをドラフトに戻す前に、キャピラリーを捨ててバイアルを閉じてください。プレートをペーパータオルの上に置き、乾燥を終了します。
   • 次に、清潔な50mLのスクリュートップジャーに「90%酢酸エチル、10%ヘキサン」とラベルを付け、きれいなメスシリンダーに入れて溶媒フードに持って行きます。
   • 90/10溶液を2〜3mL瓶に入れ、ドラフトに戻します。溶媒レベルがプレート上のスポットより下にあることを確認します。次に、きれいな濾紙を立てて瓶に入れ、しっかりと閉じます。
   • TLCプレートが乾き、濾紙が飽和したら、プレートを溶剤に慎重に置きます。手記：これを行うときは、プレートを水平に保つことが不可欠です。溶媒の前面が対角線の場合、溶媒の移動距離はスポットごとに異なるため、未知と参照スポットを視覚的に比較することは不可能です。
   • 溶媒の前面がプレートの上部から1cmに達するのを待ちます。次に、プレートを取り出し、前面に溶剤のマークを付け、平らに寝かせて乾かします。
   • プレートが乾いたら、紫外線とヨウ素チャンバーで視覚化し、鉛筆でスポットの輪郭を描きます。
   • 未知の材料は化合物の混合物である可能性があるため、3つの参照スポットすべてと一致するスポットを注意深く探してください。
   • 次に、ラボノートのプレートの図面にスポットを正確にコピーします。ソルベントフロントの高さとスタートラインに対するスポットを測定して記録します。
   • 終わったら、瓶から溶剤で飽和した濾紙を取り出し、フードで乾かします。
   • 残った溶剤を標準的な有機廃棄物に注ぎ、研究室の通常の方法でガラス器具を洗い、実験器具を片付けます。
   • 裏打ち材に応じて、使用済みのTLCプレートを実験室のゴミ箱またはガラスくずと一緒に捨ててください。
   • 最後に、フィルターが乾いたら、残っているゴミと一緒に捨ててください。
3. ResultsExpand
   • 100%ヘキサンで溶出したフェノール、安息香酸、ブチルフェニルエーテルのR_f値を計算します。TLCプレート上の各コンパウンドについて、スタートラインからそのスポットの中心までの距離を測定します。次に、この値を開始ラインから溶媒フロントまでの距離で割ります。
   • スタートラインから測定可能な距離だけ移動したブチルフェニルエーテルのみであり、これは最も極性が低いことと一致しています。効果的な分離のためには、R_f値は0.3〜0.7異なる必要があります。したがって、フェノールと安息香酸は極性が高すぎて、純粋なヘキサンのような無極性溶媒で効果的に分離できないと推測できます。
   • ヘキサンと酢酸エチルの60/40混合物で実行したプレート_のRF値を計算します。酢酸エチルは中極性の溶媒であるため、化合物はより遠くに移動し、プレート上でより間隔を空けて配置されます。
   • 分離順序は、最も極性の高い化合物である安息香酸がシリカゲルに対して最も親和性が高く、最も極性の低い化合物であるブチルフェニルエーテルがシリカゲルに対して最も親和性が低いことを示しています。これは、極性の低い化合物は極性固定相上をより遠くに移動するという仮定と一致しています。
   • 3番目のプレートを見て、アスピリン、アセトアミノフェン、カフェインのR_f値を計算します。3つの中で最も極性が高い複合体であるカフェインは、最も移動が少なかった。アセトアミノフェンは2番目に遠くまで移動し、最も極性の低いアスピリンが最も移動しました。
   • 最後に、未知の材料の中の化合物を、そのスポットまたはスポットを3つの参照スポットと比較することにより、特定します。