カラムクロマトグラフィー

概念インストラクター準備学生プロトコル
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出典:Lara Al Hariri氏とAhmed Basabrain氏(米国マサチューセッツ州アマースト校

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  1. 食品色素のカラムクロマトグラフィー

    この実験では、カラムクロマトグラフィーを使用して、緑色の食品着色料をその成分である青と黄色の色素(エリオグラウシンとタートラジン)に分離します。まず、95%エタノールを使用して、シリカゲルに対する親和性が弱い色素を溶出します。次に、カラムから2番目の色素を水で洗い流します。精製された色素を回収するために、カラムを離れる染料の各バンドを収集します。これらの収集されたボリュームは分数と呼ばれます。

    • まず、白衣、安全メガネ、ニトリル手袋を着用してください。
    • カラムまたはビュレットを中央の供給エリアに持ってきてください。綿またはグラスウールを入手し、カラムの上部に押し込みます。長くて鈍い端のワイヤーまたはロッドを使用して押し下げ、ストップコックのすぐ上のカラムを差し込みます。 手記： 綿は安定している必要がありますが、溶剤が簡単に通過する必要があるため、密に詰めすぎないでください。ストップコックがプラグに引っ掛からずに自由に回転できることを確認してください。
    • ビュレットクランプをラボスタンドに取り付け、その下に約4インチのスペースでカラムを直立させます。ストップコックが閉じていることを確認してください。
    • 100mLのビーカーに「廃棄物」のラベルを貼り、カラムの下に置きます。
    • 次に、風袋を引いた計量ボートで砂を1g測定し、ベンチに戻します。
    • 次に、綿プラグの上部から約0.5cm上に柱をマークします。
    • 列の上部に小さな漏斗を置き、プラグの上に0.5cmの深さの層があるように、漏斗に十分な砂を注ぎます。これにより、シリカゲルがプラグを通過してフラクションに入るのを防ぐことができます。
    • 漏斗を取り外し、列を軽くたたいて砂を均等に分散させます。
    • さあ、溶離液を準備します。50 mL ビーカーと 50 mL メスシリンダーに「水」とラベルを付けます。
    • メスシリンダーで50mLの脱イオン水を測定し、ビーカーに注ぎます。
    • 次に、別の50 mLビーカーと50 mLメスシリンダーに「エタノール」というラベルを付けます。95%エタノールを50mL量り、このビーカーに注ぎます。
    • さあ、きれいなパスツールピペットを4つか5つ手に入れ、ピペットバルブを手に入れましょう。カラムの内壁に沿って7〜8mLのエタノールを静かにピペットで動かします。この溶媒層により、砂を乱すことなく、このシリカゲルスラリーをカラムに注ぐことができます。
    • 活栓を開けて、~1mLのエタノールを廃棄物ビーカーに排出し、活栓から空気を洗い流し、溶媒がプラグを通って簡単に流れることを確認します。砂とプラグに乾燥した斑点がないことを確認し、カラムの側面を軽くたたいて、閉じ込められた気泡を取り除きます。
    • 次に、カラムの上部にきれいな漏斗を置き、3番目の50mLビーカーに「エタノール中のシリカゲルスラリー」というラベルを付けます。
    • シリカゲル粉末5gを慎重に計量し、ラベル付きのビーカーに注ぎます。
    • 次に、シリカゲル、ガラス棒、およびエタノールメスシリンダーをエタノールディスペンシングフードに持って行きます。
    • 95%エタノールを18mL量り、ビーカーに注ぎます。テクスチャーが均一になり、乾燥したパッチや粉末の塊が残らなくなるまで、ガラスロッドで混合物をかき混ぜます。通常、これには~1分かかります。注:スラリーはバッターのように厚くする必要がありますが、それでも簡単に流れるはずです。スラリーが硬すぎると、漏斗が詰まったり、カラムに気泡が閉じ込められたりする可能性があります。
    • 粉末がエタノールに完全に懸濁したら、ベンチに持って行きます。スラリーを再び食感が均一になるまで攪拌し、すぐにカラムに注ぎます。
    • シリカゲルが沈殿して気泡を取り除くときに、カラムの側面を軽くたたいます。
    • ビーカーを1または2mLのエタノールですすぎ、すすぎ液をカラムに注ぎます。次に、漏斗を取り外して脇に置きます。
    • カラムの内側に沿ってエタノールをピペットで動かし、壁に付着した粒子を洗い流します。次に、メニスカスがシリカゲルの上部よりわずかに上になるまで溶媒を排出します。
    • 次に、5mLまたは10mLのメスシリンダーを使用して、約0.8mLの緑色の食品色素溶液を採取します。
    • 清潔なピペットを使用して、シリカゲルの上部に5〜7滴の染料溶液を穏やかに塗布します。必要に応じて、シリカゲルを覆ったままにするために、エタノールを数滴加えます。
    • 染料が染み込むのを待つ間、2つのきれいな50mLビーカーに「エタノール画分」と「水画分」のラベルを付けます。カラムの下の廃ビーカーをエタノール画分ビーカーと交換します。
    • 次に、カラムにエタノールを充填し、最初のmLを内壁に沿ってピペッティングして、シリカゲルを乱さないようにします。
    • 次に、ストップコックを途中で開き、溶媒レベルが15〜20秒ごとに~1mL減少するまで調整します。
    • エタノールの流れを維持するために、定期的にカラムを補充してください。シリカゲルの上には常に少なくとも1cmの溶剤があることを確認してください。
    • 黄色と青の帯が分離するのを監視します。手記： 離れる必要がある場合は、ストップコックを閉じて、留守中に柱が乾かないようにします。一度に1分以上停止すると、複合バンドが広がり始めるため、避けてください。通常、動きの速い色素がカラムから出るまでに約20〜35分かかります。
    • エタノール画分ビーカーに動きの速い染料をすべて集めたら、ストップコックを閉じ、エタノール画分を脇に置き、廃棄物ビーカーをカラムの下に置きます。
    • メニスカスがシリカゲルのすぐ上に来るまで溶媒を排出します。次に、廃棄物ビーカーを水画ビーカーに交換します。
    • 清潔なピペットを使用して、カラムの上部を脱イオン水で満たします。次に、15〜20秒ごとに約1mLの速度で水がカラムを流れるように、ストップコックをできるだけ開きます。
    • 2番目の色の帯が列から完全に離れるまで、必要に応じて列に水を補充します。これには通常、さらに15〜25分かかります。次に、ストップコックを閉じて、水画ビーカーを廃棄物ビーカーと交換します。
    • さて、カラムを完全に空けて、ストップコックを開いたままにします。
    • エタノールと水の画分の色を実験ノートに記録します。

      表1:食品用色素のカラムクロマトグラフィー

      色 内容量(mL)
      エタノール画分
      水分画
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    • 対応する50mLメスシリンダーにフラクションを注ぎ、各フラクションの容量を記録します。次に、ストップコックを閉じて、カラムをドラフトに持ってきます。
    • シリカゲルが乾燥できるように、カラムをフードに直立させて固定します。インストラクターは、カラムのクリーニング方法を教えるか、ラボ後にお手入れをします。
    • さて、集めたフラクションと残ったエタノール、水、染料溶液を排水溝に流し、残りのガラス器具は通常通り掃除します。
    • 使用済みのパスツールピペットはガラス廃棄物に捨ててください。使用済みのペーパータオルと計量ボートを実験室のゴミ箱に捨て、ベンチトップを掃除してから出発してください。
  2. Results

    この実験では、エタノールが青色のエリオグラウシンを適時に溶出することがわかりましたが、黄色のタルトラジンには有効な溶離液ではありませんでした。緑色色素のペーパークロマトグラフィーも同様の結果を示しています。したがって、エリオグラウシンはタルトラジンよりもシリカゲルに対する親和性が低いと結論付けます。

    次に、2つの溶媒を使用して染料を別々に溶出する利点について考えてみましょう。水はエタノールよりも極性が高いため、エタノールのみの場合よりも速く両方の色素を溶出すると仮定します。また、水のみを使用していた場合、全体的に使用する溶媒が少なくなっていたでしょうが、分離が悪化し、純粋なフラクションを収集するのが難しくなりました。

    あるいは、エリオグラウシンを採取した後もエタノールを使い続けることもできましたが、そのようにしてタルトラジンを溶出させるには長い時間と大量のエタノールが必要だったでしょう。エリオグラウシンを溶出した後に溶離液を水に切り替えると、純度を犠牲にすることなく、時間が節約され、溶媒の無駄が最小限に抑えられます。