15.12: サンガーシーケンシング

特定の実験や診断では、存在する遺伝子や対立遺伝子、それらの機能、および関連する疾患についてより深く理解するために、生物の全ゲノムのヌクレオチド配列を取得する必要がある場合があります。これは、DNAシーケンシングを使用して達成できます。

2つのよく知られた伝統的なDNAシーケンシング技術は、サンガーシーケンシング法とマクサム・ギルバート法です。

サンガーシーケンシング(鎖末端またはジデオキシヌクレオチドシーケンシングとも呼ばれる)では、シーケンシングされる純粋なテンプレートDNAは、適切なプライマー、dNTP、およびジデオキシヌクレオチドまたはddNTPと呼ばれる修飾塩基の存在下でPCR増幅されます。

ジデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドのヒドロキシル基を欠いているため、隣接するヌクレオチドとホスホジエステル結合を形成する能力が制限されます。

また、各ジデオキシヌクレオチドには、検出を容易にするために異なる蛍光標識が貼られています。

最初のステップは、テンプレートDNAを一本鎖DNAに変性させることです。

次に、プライマーが目的領域に結合すると、DNAポリメラーゼはDNA鎖に新しいヌクレオチドを追加し始め、場合によってはデオキシヌクレオチドの代わりにジデオキシヌクレオチドを組み込みます。これにより、DNA増幅が終了します。

その結果、さまざまな長さのDNA断片ができ、それぞれが標識されたジデオキシヌクレオチドで終点します。

次に、これらのDNA断片をキャピラリーゲル上で実行してサイズに基づいて分離し、これらの各断片からの発光スペクトルを自動ソフトウェアで分析して、目的のDNAの遺伝子配列を解読します。