32.6: 細胞内分画

細胞溶解後に得られるホモジネートには、細胞内分画によってさらに純粋な画分に分離できるさまざまな膜結合細胞小器官が含まれています。 これらの分離株は、特定の細胞成分の研究、局所的なタンパク質活性の分析に使用され、診断にも使用されます。 分画は通常、遠心分離法を使用して行われ、最も一般的なのは密度勾配遠心分離と分画遠心分離です。

分画遠心分離

分画遠心分離は、サイズと密度に基づいて細胞成分を分離する比較的単純な方法です。 速度を上げながら遠心分離を続けると (10,000 X g ～ 150,000 X g の範囲)、サイズの異なる成分が沈降します。 ただし、複数の細胞小器官が同様のサイズと密度である可能性があるため、この方法では通常、粗製画分が生成されます。

密度勾配遠心分離:

細胞成分の高度に精製された画分は、密度勾配溶液中でホモジネートを分離することによって得ることができます。 密度勾配は、徐々に濃縮されたショ糖溶液など、密度が増加する溶液を遠心分離管の底部にある最も密度の高い層として層状にすることによって、遠心分離管内で調製されます。 このような勾配は、サイズと形状に基づいて細胞小器官を分離するためのレートゾーン遠心分離で使用されます。 遠心分離すると、細胞小器官は異なる密度の層を通って移動するため、沈降係数に基づいて異なる速度で沈降します。

あるいは、異なる密度の溶液をチューブの長さに沿って段階的な割合で混合することによって、連続的な密度勾配を調製することもできます。 遠心分離中、各成分はその密度に一致する位置、つまり平衡位置で固定化されます。 したがって、この方法は平衡沈降または浮力沈降としても知られています。 したがって、細胞成分と分子のこの分離は、サイズではなく密度に基づいています。

細胞内分画は、細胞溶解物から異なる細胞小器官の純粋な画分を得るために使用されます。

細胞内分画に一般的に使用される2つの方法は、示差遠心分離と密度勾配遠心分離です。

示差遠心分離では、細胞小器官のサイズベースの分離のために、徐々に速度を上げて逐次遠心分離を行います。

まず、サンプルを約400〜600 x gの低速で遠心分離して、核や細胞の破片などの大きな構造を沈殿させます。

次に、上清を10,000〜20,000 x gの範囲の高速で回転させ、ミトコンドリア、リソソーム、ペルオキシソームなどの細胞小器官をペレット化します。

さらに、80,000 x gを超える速度での遠心分離サイクルにより、ミクロソーム、膜画分、さらにはリボソームを分離することができます。

しかし、示差遠心分離では、ミトコンドリアなど、サイズや密度が非常に近い細胞小器官をペルオキシソームから分離することはできません。

このような場合、より感度の高い方法である密度勾配遠心分離が貴重なツールとなります。

この方法では、化学物質を使用して確立された密度勾配を使用します

スクロースやグリセロールなど、単一のチューブ内のサイズ、形状、または密度に基づいて細胞小器官を異なる層に分離します。