33.4: 免疫蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡は、蛍光色素と呼ばれる蛍光発色団を使用しており、光源からエネルギーを吸収し、このエネルギーを可視光として放出することができます。蛍光色素には、天然の蛍光物質(クロロフィルなど)と、コントラストを作成するために標本に添加される蛍光染色が含まれます。テキサスレッドやFITCなどの染料は蛍光色素の例です。他の例としては、核酸色素である4′,6′-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)やアクリジンオレンジなどがあります。

顕微鏡は、紫外線や青色光などの短波長励起をサンプルに照射します。発色団は励起光を吸収し、より長い波長の可視光を放出します。次に、励起光をフィルタリングして(紫外線が目に有害であることも一因)、可視光のみが眼レンズを通過するようにして、暗い背景に対して明るい色の標本の画像を生成します。

蛍光顕微鏡は、病原体を同定したり、環境内の特定の種を見つけたり、細胞内の特定の分子や構造の位置を見つけたりすることができます。また、特定の蛍光色素を取り込むかどうかに基づいて、生きている細胞と死んだ細胞を区別するためのアプローチも開発されています。時には、同じ試料に複数の蛍光色素を使用して、異なる構造や特徴を示すことがあります。

蛍光顕微鏡法の最も重要な用途の1つは、抗体が特定の微生物に結合するかどうかを観察することにより、特定の微生物を特定するために使用される免疫蛍光法です。(抗体とは、免疫系が産生するタンパク質分子で、特定の病原体に付着して病原体を死滅または阻害します。この手法には、直接免疫蛍光法(DFA)と間接免疫蛍光法(IFA)の2つのアプローチがあります。DFAでは、特異的抗体(狂犬病ウイルスを標的とする抗体など)を蛍光色素で染色します。検体に標的となる病原体が含まれている場合は、蛍光顕微鏡で病原体に結合する抗体を観察することができます。これは、染色された抗体が病原体に直接付着するため、一次抗体染色です。

IFAでは、二次抗体は一次抗体ではなく蛍光色素で染色されます。二次抗体は生物に直接付着するのではなく、一次抗体に結合します。未染色の一次抗体が病原体に結合すると、蛍光二次抗体が一次抗体に結合することが観察されます。したがって、二次抗体は病原体に間接的に付着します。一次抗体には複数の二次抗体が付着することが多いため、IFAでは検体に結合する蛍光抗体の数が増え、その特徴が可視化されやすくなります。