伝統的に垂直方向のスライスと網膜のホールマウントの準備は、網膜回路の機能を研究するために使用されている。ここで、我々は、無傷の網膜神経細胞の樹枝状形態を維持する方法をスライス小説を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
伝統的に垂直方向のスライスと網膜のホールマウントの準備は、網膜回路の機能を研究するために使用されている。しかし、このようなアマクリン細胞など網膜の神経細胞の多くは、細胞の形態が著しく垂直スライスに破損することになっているように、水平にそれらの樹状突起を展開します。ホールマウントの準備では、特にパッチクランプ記録のために、中間層の網膜神経細胞が原因でグリア細胞（ミュラー細胞）■endfeetsの広範な範囲に簡単にアクセスできません。ここで、我々は、無傷の網膜神経細胞の樹枝状形態を維持する方法をスライス小説を説明します。網膜は、低温融解アガロースゲル内に埋め込まれた後に、スライスはビブラトームスライサーを用いて網膜の内側の層で水平に行われました。網膜のこの水平方向のスライス標本では、我々はパッチクランプ記録、カルシウムのイメージング技術、免疫細胞化学、および単一細胞RT - PCRを使用することにより、その形態と比較して網膜神経細胞の機能を調べた。
プロトコル
- 寒天ブロック（30 mg / mlの、すなわち3％、蒸留水で）を準備する。溶解し、マイクロ波、それを最初にガラス皿にそれを注ぐ。 4℃の冷蔵庫に料理をしてください
ヒント：寒天ブロックが事前に準備されるべきである。
- 準備低温融解アガロースゲル（培地で25 mg / mlの、すなわち2.5％）。それを溶かし、電子レンジ。 35 O℃で湯浴に保管してください
ヒント：アガロースゲルが高すぎないキープ。それはあまりにも高温になっている場合、それが固化するのに長い時間がかかり、ゲルが網膜を殺すかもしれない
。 - 、動物を安楽死させる眼球を摘出し、アイカップのようにして開きます。硝子体液を液化するために、オープンしたアイカップは場合、必ずしも、培地中のヒアルロニダーゼで10分（0.07 mg / ml）を浸漬される。
- ブロック（例えば、マウスの網膜は1センチメートル× 1.5センチ）に寒天をカットし、しっかりと瞬間接着剤でビブラトームステージに装着。寒天ブロックが濡れてください。
- スライサーでの5度にブレードを置きます。ゆっくりと約の速度で寒天ブロックの上面をカット。 50μmの/秒、周波数。 50ヘルツ。
ヒント：寒天ブロックの上面は完全に滑らかで平らであることを確認してください。いくつかのカットは、（少なくとも3回）寒天ブロックの滑らかで平坦な表面を得るために必要になる場合があります。
- ヒアルロニダーゼを含まない培地でアイカップを洗浄します。色素上皮から網膜を分離し、フィルター紙の上に光受容側を下に置きます。しっかりと濾紙に網膜を添付するには、ろ紙上に数回の網膜を掃除。
ヒント：網膜が完全に平らなろ紙に接続されていることを確認してください。あなたがろ紙に網膜を挿入した後、（Fig.2A）網膜を囲む余分なろ紙をカット。過剰濾紙はしばしば網膜の適切な層に入ることから刃を防ぐことができます。
- 静かに寒天ブロック上に余分な培地を一掃し、慎重に寒天ブロック上にろ紙で網膜を置きます。しっかりと寒天ブロック上に濾紙を配置するには、ろ紙の端に瞬間接着剤を添付してください。
ヒント：unexpectable亀裂を避けるために、寒天ブロックの上面に可能な限りフロントとして網膜を置く。
- ゆっくりと網膜上の低温融解アガロースゲルを注ぐ。 1分間待って、ゆっくりと冷却することで培地を注ぐ。アガロースゲルは、速やかに固化になります。
ヒント：あまりにも熱いアガロースゲルは、網膜を殺す。
- 寒天ブロックの上面上に数百μmにブレードの位置を持ち上げ、ゆっくりと固化したアガロースゲルの上部をカット。
- ブレードの位置を下に下ろします。内顆粒層（寒天ブロックの上面上に200〜250μmとの約）の近位3分の1レベルで網膜をカット。
ヒント：ブレードの多すぎる速度が大幅に網膜を損傷します。約。は50μm/秒（50 Hz）は適切です。
- アマクリン細胞は今ダウンに直面していることに注意してください。慎重に固化したアガロースゲルと一緒に網膜のスライスをピックアップし、チャンバーや皿に顔をアップに置きます。
ヒント：マウスの網膜が小さいと波状なので、それは適切な層で完璧な水平方向のスライスを得ることが困難である。 "斜め"スライスは、網膜の相対的なフラットスライスを取得する別の方法があります。図2bに示すように斜めスライスを取得するには、ろ紙と寒天ブロック上に網膜の間に別のろ紙を置く。あなたが完璧な水平方向のスライスを期待することはできませんが、常にアマクリン細胞の細胞体は、スライスの表面にあるいくつかの分野があります。
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ディスカッション
網膜の水平スライス標本のいくつ重要利点があります。
最初、などアマクリン細胞や水平細胞として水平デンドライトを拡大細胞、、のモフォロジーは保持さ。それが生理プロパティとともに細胞の形態を比較するかなり重要であるよう、網膜におけるアマクリン細胞の20種類（マクニールおよびマスランド、1998）以上あることが示された。
秒、全体-マウント網膜で、グリア細胞秒endfeetsの広範カバレージはアマクリン細胞へパッチピペットのアクセスを防ぎます。水平スライスで、アマクリン細胞のソーマはスライスの表面にさらされる。
これらがスライスの表面上にあるためサード、化学試薬は容易、標的細胞およびそれら樹状突起に達するできます。洗っ-でと洗浄アウト薬品から高速かつ簡単です。
など従来カルシウムイメージングとして第四、蛍光イオンイメージングは実行できるです。伝統垂直スライスまたは全体-マウント網膜において、イメージング自体用励起光は光受容をアクティブ。水平スライス標本で、光受容およびphotopigmentsは全く励起光-誘発アーティファクトのない汚染がないことので取り除かれます。光受容のバックグラウンドアクティビティがなくなるためさらに、...
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開示事項
すべての実験プロトコールは、動物用健康ガイドラインの国立研究所に従って行った。
謝辞
我々は、博士に感謝する。網膜の水平スライスの準備の手順を確立するために、貴重なアドバイスや提案を与えるためのリチャードH.マスランドと明道金子。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 寒天 | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| アガロース L | 和光純薬工業株式会社 | 317-01182 | 低融点アガロース |
| ヒアルロニダーゼ | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| 培地 | mM単位：102 NaCl, 3.1 KCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, 10 glucose（pH 7.8に調整）、またはAmes’ Solution (Sigma) | ||
| 電子レンジ | |||
| 恒温水槽 | 35 °C | ||
| ビブラトーム切片作成装置 | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-メンブレンフィルター | EMD Millipore | HAWP01300 | フィルターペーパー、孔径 0.45 µm |
| 解剖器具 | ピンセット、メス、クランプ、ツイーザーなど。 | ||
| 瞬間接着剤 | 例： Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL シリンジ | |||
| シリンジフィルター | EMD Millipore | SX0001300 |
参考文献
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
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