環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

Summary

私たちは、環境のmRNAからcDNAを生成するための方法を提示する。一般的に、トータルRNAは、最初の環境から収集され、rRNAを選択的に除去され、mRNAが選択的に増幅され、濃縮mRNAのプールから合成したcDNAは、配列決定される。回収された配列は、発現遺伝子を識別するために、標準的なバイオインフォマティクス技術を用いて注釈を付けることができます。

Abstract

コミュニティが表現されるかもしれないものの遺伝子の事前の知識がなくてもメタゲノム、環境トランスクリプト（metatranscriptomics）を取得し、配列の微生物集団からの環境のmRNAに似ています。したがって、コミュニティの遺伝子発現に最も公平な視点を提供

Protocol

RNAの取り扱い

ので、RNaseのはユビキタスであり、mRNAが急速に劣化、リボヌクレアーゼのない環境で作業するための標準予防策に従う必要がありますし、サンプルはできるだけ早く、次のコレクションのように処理または維持する必要があります。

第1部：環境RNAコレクション （0.2〜3.0μmであるのサイズの画分にバイオマスを収集するように設計）

消耗品は必要なもの：
Masterflexチューブ
蠕動ポンプ
3μmの高ボリュームプリーツカプセルフィルター
0.22μmのスーまたはポリカーボネート142ミリメートルフィルター
142ミリメートルろ過塔（ジオテック環境装置）
10月20日Lカーボイ（卒業）
旋回パック
液体窒素
RLTバッファー（Qiagen社）
β-メルカプトエタノール

セットアップ：
フィルタの処理またはフィルタラインの内部コンポーネントに触れるたびに清潔な手袋を着用してください。鉗子は、好ましくはエタノールでいっぱい、、きれいに50 mlコニカルチューブを保つ必要があります。トランプールの主要な変更を防止するために、フィルタリングを維持し、サンプルの処理時間をできるだけ短く。

サンプリングのための所望の深さで水の中にチューブの一方の端を置きます。反対側では、3μmのフィルターハイボリュームを取り付けます。 0.22μmのフィルター塔にフィルタを3μmを接続します。卒業カーボイに0.22μmのからの流出を指示する。

手順：

1. リンスに（無0.22μmのフィルター）システムを介して水数リットルを実行します。ポンプがラインから残りの水をパージするために実行中に終了すると、水からチューブを取り外します。
2. 鉗子を使用して、フィルタタワーと近い上に0.22μmのフィルターを置きます。
3. バック水中への行の終わりを置き、ポンプの電源を入れます。フィルタの両方から空気をパージします。カーボイの卒業でろ過された水の量を監視します。
4. 目的のボリュームがフィルタリングされている場合は、水から行を削除し、システムから、残りの水をパージ。
5. とすぐにフィルターが乾燥していると、すぐに上部フィルタープレートを取り外し、フィルターを折る。旋回パックまたはβ-メルカプトエタノールでRLT緩衝液2 mlを入れた15ミリリットルコレクションチューブにフィルターを置きます。液体窒素で凍結してスナップ。

第2部：0.22μmのフィルターからのトータルRNA抽出

この部分は、メーカーの指示への修正と共にQIAGEN RNeasyミニキットを使用しています

1. 50 mlコニカルチューブにRLTバッファー（β-メルカプトエタノール付加）8mlを加えることによってビーズ鼓動チューブを準備します。 MoBio Powersoil抽出キットからのRNAのビーズの1〜2 mlを加え
2. すぐに冷凍庫から冷凍フィルタを削除すると、旋回のパックでそれを維持、木槌でそれを打ち砕く。また、無菌のカミソリの刃を使用してコレクションチューブに小さい部分（15ミリリットル）でフィルタをカットして準備したチューブ（50ml）にしてすべてのそれを追加します。
3. 準備したチューブ（50ml）にして粉々にフィルタを追加し、パラフィルムやラボのテープでチューブのふたを密封する。
4. 50 mLチューブ用アタッチメントでボルテックスを用いて最高速度で10分間ボルテックス。
5. 室温で1分間、5000rpmで50 mlチューブを遠心します。
6. 可能な限り溶解液のを削除し、15 mlのチューブに移す。
7. 5000 × gで5分、15 mlチューブを遠心
8. 新しい50 mlチューブに転送清（〜7 ml）を。
9. ライセートに100％EtOHを1容量（〜7 ml）を追加します。
10. 50 mlチューブに収まる30mlのシリンジを使用して、18から21ゲージの針を通してライセートを策定し、〜5倍のバックアウトを渡します。終了したら、シリンジ内の溶解液を残す。
11. QIAGEN RNeasyミニキットで抽出を続ける。ライセート量（〜14ミリリットル）が、元キットのプロトコール（0.7 ml）に比べてはるかに高いので、それは、ここで真空マニホールドを使用すると便利です。また、溶解物は、カラムに700μLを加え遠心分離し、ライセートがすべての列に適用されるまで繰り返すことによって、通過描画することができます。
12. 真空マニホールドにスピンカラムをセットし、サンプル700μlを適用する。ライセートを描き下ろしマニホールドに真空圧を適用します。それがすべての列に適用されるまで、シリンジからライセートを追加していきます。
13. カラムに700μlのBuffer RW1を追加し、真空圧で引き倒す。
14. カラムに500μlのBuffer RPEを追加し、真空圧で引き倒す。
15. カラムに500μlのBuffer RPEの第2のアリコートを追加し、真空圧で引き倒す。
16. 洗浄が完全に引かされた後、コレクションチューブにカラムと場所を削除します。
17. 8000 x gで1分間チューブを遠心フロースルー捨てる。
18. エタノールを取り除くために8000 x gでさらに2分間遠心する。
19. 新しい2 ml colにカラムを移しlectionチューブ。直接メンブレンにRNaseフリー水をピペットで35μlの。チューブを閉じて1分間放置する。
20. 8000 x gで2分間遠心する
21. 分光光度法で全RNAを定量化する。

第3部。 DNase処理

この部分は、製造元の指示に従って、Ambion社TURBO DNA -フリーキットを使用しています

1. RNAサンプルを、3.4μlの10xのDNase Iをバッファーと1μlのrDNase私を追加。
2. 30分間37℃でインキュベートする。
3. 渦のDNase不活化試薬を、サンプルに不活化試薬3.4μLを加える。
4. 時々混合しながら室温で2分間インキュベートする。
5. 室温で1.5分間10.000 × gでスピンし、上清を新しいチューブに移す。新しいチューブに不活化試薬を導入することは避けてください。

パート4。最初のrRNAの除去

この部分は、製造業者の指示に従ってEPICENTREのmRNA - ONLYキットを使用しています

1. 穏やかに混合し、簡単に使用する前のmRNA - ONLY 10X反応バッファーを遠心してください。
2. 滅菌（RNaseフリー）0.5 mlチューブでは、氷上で以下の反応成分を組み合わせる。

   mRNAのONLY 10X反応バッファー	2.0μL
   RNase阻害剤	0.5μL
   トータルRNAサンプル（200 ngの-10μgの）	μL16.5
   ターミネーターのエキソヌクレアーゼ（1ユニット）	1.0μL
   合計ボリューム	20.0μL

3. 30℃で反応をインキュベート、60℃サーモで分（フタ付）や水浴のためのC。
4. フェノール/エタノール沈殿で反応を終了させる。
   1. 200μlの総体積（= 180μL）にRNaseフリーの水を追加します。
   2. 抽出液：フェノール：クロロホルム（1:1）、1ボリューム（=200μl）を。渦は、精力的にしてからトップスピードで2〜5分間スピン。
   3. 水相を（〜200μl）を取り外します。
   4. 3 M酢酸ナトリウム（20μlの）100％氷冷エタノールの+ 2.5容積（500μl）を0.1ボリュームを追加する
   5. 15〜30分間-80℃でインキュベートする。
   6. 4℃、最高速度、30分でのペレットは、サンプルの後の誤嚥（ペレットが見えにくいことができる）のためのチューブの位置に注意してください。
   7. アスピレーターまたはピペットで上清を捨てる。
   8. 500μlの70％氷冷エタノールで洗浄する。ボルテックスで懸濁します。
   9. トップスピードで10分間遠心する。上清を捨てる。
   10. チューブ再びトップスピードで10分·残留液を遠心してください。
   11. 慎重に液体を吸引し、それがボンネットの下で〜10分間開いたままで、完全にペレットを乾燥させます。
   12. 15〜20μlのRNaseフリー水で再懸濁し（MICROBExpressの最大入力の音量は15μlです）、それが室温で5分間放置する。
   13. このステップではmRNAのrRNAのコンタミネーションや品質をチェックするためにバイオアナライザまたはExperionを使用してください。
   14. これは、潜在的な停止ポイントです。 RNAは-80℃の貯蔵で保存することができます。

第5部。第二のrRNAの除去

この部分は、製造元の指示に従ってアンビオンMICROBEnrichとMICROBExpressキットを使用しています。両方のキットは、真核生物の効率（MICROBEnrich）と原核生物（MICROBExpress）rRNAの除去を増加させるために複数回使用することができます。トータルRNAの入力は、2〜10μgの間でなければなりません。 RNAの量は15μL未満にする必要があります。従って、理想的な入力は> 150 ng /μLのです。 -

MICROBEnrich

1. ピペット1.5mlチューブに300μlの結合バッファー
2. 30μlの、穏やかにボルテックスの最大ボリュームで500から100μgのトータルRNAを追加
3. 結合緩衝液中で5μgのRNAのキャプチャーオリゴミックスの2μlを添加する。軽くチューブをタップして、簡単に混合物をスピンダウン。
4. 70変性の混合℃で10分間
5. 37℃で1時間混合物をアニール。このインキュベーションの間にビーズを準備します。
6. ヌクレアーゼフリー水で回洗浄し、一度結合緩衝液で、洗浄の間に磁気スタンドでビーズをキャプチャすることによりオリゴMagBeadsを（通常は25μl）を用意してください。氷の上にビーズを保管してください。使用前に室温で5分間にウォームアップ。
7. ° Cヒートブロックで37に洗浄液を加熱する。
8. RNA /洗浄したオリゴMagBeadsにオリゴミックスをキャプチャを追加。非常に穏やかにチューブを混ぜると簡単にスピン。
9. 37ミックス℃で15分間インキュベートする。
10. 磁気スタンドにチューブを置き、〜3分待つ。
11. 上清を吸引（mRNAを含んでいる）とは、氷上でコレクションチューブに移す。
12. キャプチャされたビーズに予め温めておいた洗浄溶液100μlを追加。簡単に静かに渦ビーズ。
13. ビーズをキャプチャし、上清を回復する。氷の上でコレクションチューブ（〜450μlの最終体積）のmRNAのプールこの上清​​を。
14. 氷上でコレクションチューブを置きます。第二ラウンドが実行されようとしている場合、5.3に戻って）セクションと手順を繰り返します。また、MICROBExpressキット（5.18、下記参照）に即座に切り替える。
15. 使用OlioBeadsは2回目に使用することができます。 1時間再生溶液1の2倍量（通常は50μlの）でそれらをインキュベートすることにより、Oligobeadsを再生成します。マグネチックスタンドでビーズをキャプチャします。再生溶液2（通常は50μL）の2容量で二回、それらを洗浄し、再懸濁液を元のボリューム（通常は25μlの）で再懸濁します。
    MICROBExpress
16. ピペット1.5mlチューブに200μlの結合バッファー。
17. 静かに15μlと渦の最大量で20から10μgのトータルRNAを追加。
18. 結合緩衝液中でRNAにキャプチャーオリゴミックスの4μlを添加する。軽くチューブをタップして、簡単に混合物をスピンダウン。
19. 70変性混合℃で10分間。
20. 37混合物をアニール℃で15分間は、このインキュベーションの間にビーズを準備します。
21. 洗浄の間に磁気スタンドでビーズを捕捉50μlの結合バッファーで2回洗浄、続いてヌクレアーゼフリー水で一度洗浄することによりオリゴMagBeadsを準備します。 37 50μlの結合バッファーでインキュベートで再懸濁し、ビーズ℃で使用するまで。
22. 37に洗浄液を加熱℃のヒートブロックで
23. 渦は優しくオリゴMagBeadsを洗った。 RNA /オリゴミックスをキャプチャするために50μlのオリゴMagBeadsを追加。非常に穏やかにチューブを混ぜると簡単にスピン。
24. ℃で15分間37℃で混合してインキュベートする。
25. 磁気スタンドにチューブを置き、〜3分待つ。
26. 上清を吸引（mRNAを含んでいる）とは、氷上でコレクションチューブに移す。
27. キャプチャされたビーズに予め温めておいた洗浄溶液100μlを追加。簡単に静かに渦ビーズ。
28. ビーズをキャプチャし、上清を回復する。氷の上でコレクションチューブ（〜350μlの端の体積）のmRNAのプールこの上清​​を。
29. 第二ラウンドが実行されようとしている場合、セクション5.18）に戻って手順を繰り返します。また、降水量をmRNAにすぐに進んでください。
30. 沈殿物を再懸濁します発現：
    1. プールされたmRNAと35μlの酢酸ナトリウムを加えると7μlのグリコーゲンを追加します。
    2. 1175μlの氷冷した100％EtOHを、徹底的にボルテックスを追加。
    3. 少なくとも1時間-20℃で沈殿。
    4. 10.000 x gで30分間遠心する
    5. 上清を注意深くデカントして捨てます。
    6. 750μlの氷冷70％エタノールと渦の短時間を追加。
    7. 10.000 × gで5分間遠心し、上清を捨てる。
    8. 第二70パーセントエタノールで洗浄してください。
    9. 簡単に言うと廃棄秒後に70パーセントエタノールで洗浄してチューブをリスピン。
    10. 注意深くピペットで任意の上清を取り除く。
    11. 空気は5分間ペレットを乾燥させる。
    12. 25μlのTEバッファーまたはRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁します
    13. 室温で15分間RNAを水和。
    14. ボルテックスサンプル精力的に必要に応じて。
31. それが必要な場合は、残りのビーズを取り除く場所〜3分のためのマグネチックスタンドでチューブと新しいRNaseフリーのチューブに濃縮されたmRNAを移動する。
32. このステップではmRNAのrRNAのコンタミネーションや品質をチェックするためにバイオアナライザまたはExperionを使用してください。
33. これは、潜在的な停止ポイントです。 RNAは-80℃の貯蔵で保存することができます。

パート6：mRNAの増幅

この部分は、製造元の指示に従って、Ambion社MessageAmp II -細菌のキットを使用しています。マスターがオンラインでミックス計算www.ambion.com/tools/ma2bact 。

1. テンプレートRNAのポリアデニル化：
   1. トータルRNAの1000 ngの（通常は100〜500 ng）をまたは無菌のRNaseフリーのマイクロチューブに最大500 ngのmRNAの（典型的には10 ng - 200 ng）をするまで置きます。最初のバッファでは6.5試料の添加と無RNaseフリー水を使用してください。
   2. 望ましいサーモサイクラーで、70℃で10分間インキュベートする。
   3. チューブの下部に表示されているサンプルを収集するために70℃のインキュベーターと遠心短時間（〜5秒）からのRNAサンプルを削除します。 3分間氷上に置きます。
   4. 計算シートに示されている順序で室温、ヌクレアーゼフリーのチューブにポリアデニル化マスターミックスを調製する。ピペッティングエラーをカバーするため≤5％の超過を含む実験ではすべてのサンプル、のための十分なマスターミックスを組み立てます。酵素を失活させずに均一な混合物を作るために穏やかにボルテックスし、チューブの下部にマスターミックスを収集するために〜5秒間遠心します。
   5. 、各RNAサンプルへのポリアデニル化マスターミックスの3.5μlを穏やかにボルテックスで混和すると反応を収集するための迅速なスピンで従ってください。
   6. 37℃のインキュベーターにサンプルを置きます。 15分間反応をインキュベート37℃で、その後、チューブの底部での反応を収集するためにスピンダウンする。
   7. 37℃のインキュベーションの後、氷上で反応を置いて、逆転写するためにすぐに進む。
2. 第一鎖cDNAを合成する逆転写：
   1. 計算シートに示されている順序で室温、ヌクレアーゼフリーのチューブ内で逆転写のマスターミックスを調製する。ピペッティングエラーをカバーするため≤5％の超過を含む実験ではすべてのサンプル、のための十分なマスターミックスを組み立てます。酵素を失活させずに均一な混合物を作るために穏やかにボルテックスし、チューブの下部にマスターミックスを収集するために〜5秒間遠心します。
   2. 穏やかにボルテックスで完全に混合し、反応を収集するための迅速なスピンで、次の各サンプルに逆転写のマスターミックス10μlを移す。
   3. 42℃インキュベーターにサンプルを置きます。 42で2時間インキュベート° Cは、その後、チューブの底部での反応を収集する（〜5秒）軽く遠心する。
   4. チューブを氷中に置き、すぐに第二鎖cDNA合成に進んでください。
3. 第二鎖cDNA合成：
   1. 氷の上で、計算シートに示す順序で以下の試薬を混合することによって第二鎖のマスターミックスを調製する。ピペッティングエラーをカバーするため≤5％の超過を含む実験ではすべてのサンプル、のための十分なマスターミックスを組み立てます。酵素を失活させずに均一な混合物を作るために穏やかにボルテックスし、チューブの下部にマスターミックスを収集するために〜5秒間遠心します。
   2. 、各サンプルの第二鎖のマスターミックス80μlを穏やかにボルテックスで混和する、と反応を収集するためのクイックスピンで従ってください。
   3. 16 ° Cサーマルサイクラーにサンプルを置きます。それは、16 ° Cまでの温度に反応が> 16 ° Cは、aRNAの収量が損なわれる施すので、反応チューブを追加する前に、サーマルサイクラーのブロックを冷却することが重要です。
   4. 16で2時間インキュベートする1​​6の° Cインキュベート2時間℃のサーマルサイクラー。蓋の温度が16 ° Cのブロックの温度に合わせて調整することができない場合、フタがオフになって反応をカバーし、またはふたを回すことができない場合は、オフかそれでチューブをカバーしない。
   5. 氷を短時間で反応を置きます。長時間の氷上で反応を放置しないでください。
4. 5.4）cDNAの精製：
   1. この精製手順のすべての遠心は室温で10,000 × gで（通常は〜10,000 rpm）で行われる必要があります。それを使用する前に、降水量のcDNA結合バッファーを確認してください。沈殿物が表示されている場合は、37℃まで10分のためのソリューションを温暖化と積極的にボルテックスでそれを再溶解。使用前に室温に冷却してください。
   2. cDNAの精製を開始する前に、予備加熱50℃で少なくとも10分間のNuclease - Free Water 10mlのボトル。
   3. 各サンプルにcDNAを結合バッファー250μlを加え、軽くボルテックス。
   4. 10,000 gで〜1分間遠心操作し、または混合物は、フィルターを介して行われるまで。フロースルーを捨て、洗浄チューブにcDNAのフィルターカートリッジを交換してください。
   5. それぞれのcDNAをフィルターカートリッジに500μlの洗浄バッファーを適用します。 10,000 gで〜1分間遠心操作し、またはすべての洗浄緩衝液は、フィルターを介して行われるまで。フロースルーを捨て、エタノールの微量を削除するには、追加分のcD​​NAフィルターカートリッジを回転させる。
   6. cDNAを溶出チューブにcDNAのフィルターカートリッジを転送する。 50 ° Cヌクレアーゼフリー水20μlでcDNAを溶出します。 cDNAを溶出に50℃であるのNuclease - Free Water ° Cを使用することが重要です。冷たい水は、cDNA、および熱い水（> 55 ° C）を溶出で効率が落ちます低下aRNAの収量になることがあります。
   7. cDNAのフィルターカートリッジのフィルターの中央に、予熱（50℃）のNuclease - Free Water20μlを適用する。 10,000 × gで約1.5分間遠心操作し、2分間、室温でおくと、またはまで、すべてのヌクレアーゼフリー水はフィルターを通してです。二本鎖cDNAは、現在（〜16μl）の溶出になります。
   8. 必要に応じて精製したcDNAは-80℃で、この時点で一晩保存することができます。
5. aRNAのを効果的に合成するin vitro転写
   1. それがあるため、その均一な温度でハイブリダイゼーションオーブンを使用することをお勧めします、そしてそれは、結露がチューブ内に形成しないことが極めて重要であるためです。我々は強くaRNAの収量を最大にするために14時間のIVT反応のインキュベーションをお勧めします。最高aRNAの収量の場合は、40μlの最終反応容量にIVTを行う。
   2. 室温では、計算シートに記載されている順番で試薬を添加することによりIVTのマスターミックスを組み立てます。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 colに遠心短時間（〜5秒）氷上でチューブと場所の下部にIVTのマスターミックスをlect。
   3. 計算シートのガイドラインに従って、各サンプルへの転送IVT Master Mixは、穏やかなボルテックス、反応を収集し、37℃のインキュベーターにチューブを配置するためにスピンダウンする。
   4. 37℃で14時間インキュベート℃に
   5. インキュベーション後、100μlに、最終的なボリュームを持って各aRNAのサンプルにヌクレアーゼフリー水を加える。穏やかなボルテックス。 aRNAの精製工程を直ちに実行する場合は氷上に希釈したaRNAのを置きます。また、aRNAを-20℃で保存することができます
6. aRNAの精製
7. このセクションのすべての遠心分離は、10.000 XG（通常は〜10,000 rpm）で行われる必要があります。
8. 55 aRNAの精製予熱ヌクレアーゼフリー水を10 mlのボトルを開始する前に° C> 10分間。
9. 各aRNAのサンプルへのaRNAのBinding Bufferを350μlを添加する。穏やかにボルテックスでよく混合し、直ちに次のステップに進みます。
10. 250各aRNAのサンプルにACSグレードの100％エタノールの添加、そして上下に3回混合物をピペッティングにより混和する。混在させるボルテックスしないでください。とすぐに、各サンプルにエタノールを混合したとして、次のステップに進んで。
11. aRNAのコレクションチューブにaRNAのフィルターカートリッジを置き、aRNAをフィルターカートリッジのフィルターの中央部に各サンプルの混合物をピペットで。
12. 10,000 × gで約1分間遠心混合物がフィルターを通過するまで続けます。フロースルーを捨て、aRNAのコレクションチューブにaRNAのフィルターカートリッジを交換してください。
13. 各aRNAのフィルターカートリッジに650μlの洗浄バッファーを適用します。 10,000 xgで〜1分間遠心操作し、またはすべての洗浄液は、フィルターを介して行われるまで。フロースルーを捨て、エタノールの微量を削除するための追加〜1分間aRNAのフィルターカートリッジを回転させる。
14. 新鮮なaRNAのコレクションチューブに移すフィルターカートリッジ（秒）。フィルタの中心に、50〜60に予熱され75μlのNuclease - Free Waterを℃を追加50〜60℃インキュベーターでコンテナのヌクレアーゼフリー水を交換してください。
15. 10,000 × gで約1.5分間遠心操作し、2分間、室温でおくと、またはまで、溶液はフィルターを通してです。
16. ヌクレアーゼフリー水の第75μlの溶出を繰り返します。 aRNAのは今のNuclease - Free Water〜150μlのaRNAのコレクションチューブになります。 aRNAのフィルターカートリッジを捨てる。
17. -80店舗aRNAの℃、凍結融解を最小限に抑える。

パート7：cDNA合成

この部分は、メーカーの指示にわずかな修正でプロメガユニバーサルRiboClone cDNA合成システムキットを使用しています。標準入力2μgを、454シーケンシングのために、それは10μgを開始することをお勧めします。濃度が低すぎる場合は、aRNAをエタノール沈殿または減圧濃縮いずれかを使用して濃縮することができる。 10μgのはRNAの入力として使用されている場合、各バッチに異なる単位で来る5The酵素の要因により、すべての試薬 ​​をスケールアップする、そのためボリュームは、それぞれの時間を計算する必要があります。

1. 最初の鎖の合成：
   1. 0.5ミリリットルのPCRチューブを取ると追加します。

      mRNAのサンプル	2μgの（または10μgの454配列決定のために使用されている場合）
      ランダムヘキサプライマー（0.5 mg / ml）を	2μlの
      ボリュームへのヌクレアーゼフリー水	0（または非は試料が希釈されていない）
      合計ボリューム	15μlの

   2. ℃で10分間70に反応を加熱する。氷上で5分間チューブを冷却し、チューブの底に溶液を回収するために簡単にスピン。
   3. 次の順序でコンポーネントを追加します。

      サンプル	15μlの
      最初のストランド5Xバッファー	5μlの
      RNasinリボヌクレアーゼインヒビター40 U	μlの1 ... 40 U /μlの
      合計ボリューム	21μlの

   4. ミックスreactionとスピン簡潔に。 37℃の熱混合℃で5分間。
   5. 次のコンポーネントを追加します。

      ステップ1からのサンプル	21.0μL
      ピロリン酸ナトリウム、40mMの	2.5μlの
      AMVリバースTrancriptase 30 U	μlを1.5〜 22 U /μlの
      ヌクレアーゼフリー水	0.0μL
      合計ボリューム	25.0μL

   6. ℃のハイブリダイゼーションオーブンで37℃で1時間反応をインキュベートする。
   7. 氷上でインキュベーションの場の反応の後に。
2. 第二鎖の合成：
   1. 次のコンポーネントを追加します。

      ファーストストランド反応	25.0μL
      第二のストランドの2.5倍のバッファ	40.0μL
      BSA、1 mg / mLの	5.0μL
      DNAポリメラーゼI 23 U	3.0μL
      RNase H活性0.8 U	μlを0.5〜 1.5 U /μL
      ヌクレアーゼフリー水	μL26.5
      合計ボリューム	100.0μL

   2. チューブをフリックで静かに混和。 14で反応をインキュベートしますサーマルサイクラーでのCで2時間。 ° Cの反応チューブを追加する前に14にサーマルサイクラーを冷却することが重要です。反応は14℃以上の反応の前または使用中に取得させてください。
   3. 反応を終了するには、反応にμgの入力のmRNAあたりT4 DNAポリメラーゼの2ユニットを追加します。 14で10分間インキュベート℃を
   4. 氷の上に500mMのEDTA扱わDEPCと場所の10μlを加え、反応を停止させます。
   5. 製造元の指示に従ってエタノール沈殿またはプロメガウィザードDNA -クリーンシステムのいずれかを用いてcDNAを清掃してください。 -80℃ストアサンプル℃の二本鎖cDNAは、直接この時点でpyrosequencedすることができます。

Discussion

天然の微生物群集による遺伝子発現の調査では、微生物の生態学的役割と機能を探求するための手段として近年一般的になっている。海洋微生物の検出、定量、および特性評価と組み合わせて使用​​される、遺伝子発現の解析は、自然の微生物群集に機能するように系統発生をリンクするために使用することができます。機能的な遺伝子発現を標的とするための多くの技術は、特定のプローブまたは既知の配列の遺伝子のために設計されたプライマーセットに依存しています。対照的に、環境へのトランスクリプトは、既存のシーケンスのデータによって課される制約を受けることなく、積極的に発現しているそれらの遺伝子のための優先順位を持つ遺伝子の発現を調べるために使用することができます。環境中のmRNAのプールの分析は、したがって、主要な活動と、それらを媒介する生物間の接続を発見する最も効果的な方法の一つを提供することができます。

環境トランスクリプトの最初のアプリケーションは、自然生態系の³の細菌のmRNAのプールの組成と力学の最初のビューのいずれかを提供する。沿岸の塩湿地（サペロアイランド、ジョージア州）とアルカリ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerSoil ビーズチューブ	キット	MoBio	12866-25-PBT
RNeasy ミニキット	キット	Qiagen	74104
TURBO DNA-free	kit	Ambion	AM1907
mRNA-ONLY 原核生物 mRNA 単離キット		キット Epicentre Biotechnologies	MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit	kit	Ambion	AM1905
MICROBEnrich kit		Ambion	AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit	kit	Ambion	AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	kit	Promega Corp.	C4360
ウィザード DNA クリーンアップ システム	キット	プロメガ	A7280