ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2

サマリー

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。 3パート2。

プロトコル

パート1：RNAからcDNA合成

1. アンビオンアミノアリルMessageAmp IIキットを使用する前に、洗浄バッファーに100％エタノールの推奨量を追加します。
2. PCR反応チューブに、100ngの間にT7オリゴ（dT）プライマーのトータルRNAと1μlのの5μgに追加します。ヌクレアーゼフリー水で12μlにボリュームを起動します。
3. 70でサンプルをインキュベート℃でサーマルサイクラーで10分間。
4. ° Cと遠心簡単に70からRNAサンプルを削除します。氷の上に置きます。
5. 第^{1ストランド}合成のマスターミックスを調製し、（エラーをピペッティングするための10％超過付き）、室温でおいてください。（表1）
6. ミックスして、手短に遠心して静かにピペットでマスターミックスまたはフリックします。
7. 各RNAサンプルにマスターミックスの8μlを転送する。 3〜4回上下にピペッティングして混ぜる。
8. サーマルサイクラーで2時間、42℃でインキュベートする。
9. 氷上で遠心サンプルの短時間と場所。すぐに二本鎖DNAの合成の次のステップに進みます。
10. 氷上で2 ^回目のストランドの合成マスターミックス（エラーをピペッティングするための10％超過と）。（表2）を準備
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ディスカッション

重要なステップ

配列データにバイアスが観察されているとして、増幅の第二ラウンドはお勧めできません。それぞれの酵素のステップのインキュベーションが適切な温度になるように各酵素段階（第¹回および第²鎖cDNA合成、IVT）で慎重に混合することは、良好な増幅収量を得るために重要です。さらに偏差を空気のハイブリダイゼーションオーブンまたは水浴のハイブリダイゼーションにIVTの間に2〜3度と小さいが大幅に増幅産物の収量に影響を与える可能性が - 調整可能なフタ付きのPCRサーマルサイクラーが好ましい。

アプリケーション/意義

このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Amino Allyl MessageAmp II aRNA増幅キット	試薬	Applied Biosystems	AM1753	20反応分
Amino Allyl MessageAmp II aRNA増幅キット	試薬	Applied Biosystems	AM1821	100反応分、96ウェル形式
NanoDrop ND-1000 UV-VIS分光光度計	その他	NanoDrop	ND-1000	または同等の分光光度計