HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。パート3は、蛍光色素のアミノアリルカップリングにより、両方のホストとウイルスのサンプルから増幅されたRNAを標識するプロセスを説明します。 3のパート3。
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この記事について
サマリー
プロトコル
パート1：aRNAの標識：色素のアミノアリルカップリング
- 1.5ml微量遠心チューブにaRNAのサンプルの1μgのを追加。
- 彼らは完全に乾燥されるまで低いかゼロの熱で試料をドライ真空。とすぐに乾燥しているとして、各チューブにフタを- 乾燥し過ぎたしないでください！
- 各チューブに9μlカップリング緩衝液を加え、穏やかに1分間ボルテックスでaRNAを再懸濁します。チューブの底にサンプルを収集するために手短に遠心し、サンプルが氷の上に座ってみましょう。
- Cy3またはCy5色素の各チューブに22μlの高品質のDMSOを追加。染料の一管は十分な2サンプル用です。 Cy3標識色素は、参照試料を標識するためです、とCy5色素は、テストサンプルを標識するためです。
- 渦染料が完全に混合する。使用する準備ができるまで暗闇の中で染料を保管してください。使用する前に、前の1時間より染料を用意しないでください。水がどの時点でも染料/ DMSO混合で取得しないことを確認します。
- 各サンプルに準備DMSO / Cyの染料の11μlを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。
- 室温で30〜45分インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。
- インキュベーション後、反応をクエンチするために各サンプルに4.5μlhydroxlyamineを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。
- 室温でさらに15分間インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。
パート2：aRNAのクリーンアップ標識
- 簡単に渦RNA結合ビーズを使用前であっても混合物を得ること。
- 室温でaRNAの結合ミックスを準備します。（表1）
- ボルテックスでよく混ぜる。
- 少なくとも10分間50〜60℃で1.5mlチューブとインキュベートにaRNAの溶出バッファーをAliquote。
- 各サンプルにaRNAの結合ミックスの70μlを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- PCRプレートから96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。
- 各サンプルに100％イソプロパノール50μlのを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- やさしく徹底的にサンプルを混ぜるために、少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振る。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。上清は、明るいピンク色または非法人の色素分子のためにこの時点では明るい青のいずれかでなければなりません。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 各ウェルに100μlのaRNAの洗浄液を追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、完全にこの段階では分散されないことがあります。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 100μlのaRNAの洗浄溶液で洗浄2回目のタイムを繰り返します。
- 第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカー上で1分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。サンプルを乾燥し過ぎたしないでください！
- 各サンプルに20μlの予熱aRNAの溶出バッファーを添加することによりビーズからaRNAのを溶出する。
- 精力的に3分間オービタルシェーカー上でプレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。
- 磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。上清は、クリーンアップ、ラベルされたaRNAのサンプルが含まれており、淡いピンクや淡いブルーのどちらかでなければなりません。
- 慎重に新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に溶出されたaRNAを転送します。
- （オプションの手順）は、マイクロアレイのモジュールを使用して光度計分光光度計に1.5μlずつを測定することにより、サンプル中のRNAの濃度と色素の量を確認してください。
- あなたがハイブリダイゼーションのための準備が整うまではすぐに代わりにお好みのマイクロアレイプラットフォームにラベル付けaRNAをハイブリダイズする、または、あなたは、-80 ° Cで標識したaRNAを保存することができます。
表1 aRNAをバインドミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| RNA結合ビーズ* | 10μlの |
| ビーズの再懸濁ソリューション* | 4μl |
| 100％イソプロパノール** | 6μl |
| aRNAの結合バッファー濃縮液 | 50μlの |
*とRNA結合ビーズをミックスビーズ懸濁液第一
**イソプロパノールを追加し、aRNAの結合バッファー濃縮液を添加する前によく混ぜる。
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ディスカッション
重要なステップ
アミノアリルカップリングを実行するとき、それはカップリングの前にすぐにDMSO（1時間未満）で色素を再懸濁し、それが染料でアクティブグループと反応するので、水が、染料/ DMSO混合に入ったことを確認するため、重要です。 RNAを（1 - 2uLではなく、完全に乾燥するまで乾燥することができます）乾燥し過ぎた、そしてカップリングバッファにうまく懸濁しないでください。カップリング反応中に、時折のフリックで、暗所で反応を維持し、必要に応じてスピンダウン。
アプリケーション/意義
このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。
カスタム設計されたポックスウイ...
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開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
謝辞
ホワイトヘッド研究所フェローファンド
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| CyDye ポストラベリング反応性染料パック | 試薬 | GE Healthcare | RPN5661 | Cy3およびCy5染料の両方を含む |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度計 | その他 | NanoDrop | ND-1000 | または同等の分光光度計 |
参考文献
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