方法論記事

ロブスター属Americanus口胃神経系の解剖

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DOI:

10.3791/1171

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2009年5月28日

 , 
1Volen Center for Complex Systems, Brandeis

この記事について

サマリー

我々はアメリカのロブスターの胃から口胃神経系の微細な解剖を説明します（ロブスター属americanus）。

要約

どのように神経系の活動を生産し、環境への対応を理解することを目標に、神経科学者が関心の活性を発揮し、アクセス可能と実験的手法に従順なモデルシステムに電源を入れます。アメリカンロブスターの口胃神経系（STNS）（

プロトコル

前にこのプロトコルを開始するロブスターの胃は、動物から削除され、コンパニオンのJoveの記事（ビアーマン＆トビン、2009）に記載のように準備する必要があります。以下の手順の大半は、解剖顕微鏡下で実行する必要があります。

一部交連神経節を私は絶縁型

  1. オリエント料理は、その前端が（唇で）あなたと後端（幽門によって）から離れていることをあなたに向かっています。

  2. それは皿に、できるだけ平らになるように胃が固定されていることを確認します。
    1. 唇の両側に食道を突き止める。
    2. 必要に応じて、総郭の間に配置された他のピンを再配置する。
  3. 皮下組織を削除します。
    1. gm2/gm3筋肉の近くに皮下組織をつかむ、これらの筋肉から、それを切り離して、ゆっくりと前方方向に引き出します。
    2. すべての接続をsnippingによって下にある脂肪から皮下組織を分離。口胃神経系の重要な部分を囲む中央の動脈、周りの増加は十分に注意してください。 gm1b筋肉の間に位置する口と胃の神経節、の約0.5cmの半径内皮下組織はそのままにしておきます。
    3. 分離された皮下組織を切り取ります。
  4. 基盤となる組織から脳を切り離します。
    1. 胃の前方部分の交連神経に脳の前方部分から両側に投影する二つの大きな交連神経を識別します。
    2. これらの神経はそのままに、静かにピンセットで脳を持ち上げて、組織の他の部分から脳を分離するカット。口と胃の神経は脳の下にあるとそのまま保持する必要があるとして、これを行うように注意してください。
  5. 周囲の組織から交連神経節を区切ります。
    1. 交連神経のどれか1つを1交連神経に従ってください。
    2. イオンと息子を識別する-これらの神経はそのまま残す必要があります。交連神経節は、外放射多くの神経を持つことになります。 （ イオンと息子を除いて）それらのほとんどをカットしますが、解剖を終えながら、場所に交連神経節を保持するために取り付けられたつの余分な神経を残す。
    3. 他の交連神経節で繰り返します。
  6. 外側から内側へのイオンと息子を清掃してください 。胃への神経系を固定するために唇神経はそのままにしておきます。食道神経節は、 イオンの sが交差していた座っている。あなたが劣った心室神経をつかんで下にカットするまで引き上げてその下にクリアすることができます。

パートII -分離口と胃の神経節（STG）と残りの神経を。

  1. 周囲の組織からSTGを区切ります。
    1. STGはgm1b筋肉やダウンgm2a、bの筋肉の間で実行される動脈の内部に位置しています。 gm2a、bの筋肉に近い動脈の断端を探してください。
    2. DVNを公開するために、上と前方動脈の切断端を引き出します。あなたが残りの皮下組織のレベルに達するまで引き上げ続けます。一度分離した、動脈は、それが残りの皮下組織に接触するレベルにトリミングすることができます。
    3. ロブスターの演壇に位置していた筋弁を切り取ります。
    4. 動脈がSTG上記の脂肪の内側トンネルを作ることが観察、動脈上の皮下組織を持ち上げて。動脈の内側にはさみの一刃を入れ、その上の筋肉を切る。あなたが安全にSTGを超えている確かにカットのように、DVNを見ることができることを確認してください。動脈以下、前方にカット続けます。あなたがSTGの上にカットとして、STNがダウンして筋肉へのSTGとダイビングから前方に放射さ見ることができます。完全にSTGの上に筋肉を分離するために前方カット続けます。
    5. 離れてSTNから任意の組織をクリアします。
  2. 周囲の組織からAGNのを区切ります。 （あなたがAGNから録音する予定がない場合でも、あなたは、細胞内記録のための神経節を突き止めるために無傷の神経の部分が必要になります。）
    1. より良いAGNのを確認するには、残りの皮下組織および基礎となる筋肉の薄い層を取り除く。
    2. STGへのちょうど後方、DVNの両側に脂肪と筋肉の暗いトンネルを識別する。
    3. トンネル内の1つはさみの刃を貼り、神経、上記の組織をカット。それを分離するために、神経以下、横方向に切断続ける。 （カップルミリメートル神経節を固定するのに十分ですが、そこから録音する場合はAGNの5mm以上を公開。）
    4. それは接続を切断することによりinnervates筋肉からAGNを切り離します。
    5. 他のAGNを分離するために反対側に繰り返します。
    6. 両方AGNのが解剖された後、胃にSTGを接続しているすべての筋肉と組織をカット。
  3. MVN sを分離する彼らはLVNから分岐し、脂肪の下に横方向に横断する小さな神経の二国間のペアです。
    1. で2つLVN Sには、枝の近くに、DVNの片側に脂肪カットスルーにハサミまたは2つの鉗子を使用してどちらかここでは、MVNのほど遠いものであり、それらをカット危険にさらすことはありません。
    2. 脂肪層を持ち上げ、そして小さなMVNの下を識別する。これらの神経はgm1b筋肉のレベルまで横方向にちょうど後部内側を走る。
    3. 今のようにそれがもつれにならない神経はそのままに、MVN上記の脂肪の層を取り除きます。あなたは、解剖の終わりに胃オフからその外側端をカットします。
    4. 他のMVNを分離するために反対側のプロセスを繰り返します。
  4. LVNのと後部神経を分離します。
    1. ここで、横方向にDVNオフLVNの分岐からは、その上に脂肪をカットしてLVNに従ってください。準備に応じて、時には神経上記の全体の脂肪層をオフにプルアップすることができます。
    2. PSNの枝がオフ点まで、LVNを明らかに続ける。
  5. pynを分離する。
    1. pynを見つけ、それが幽門を介して後方に移動する神経です。
    2. この領域をカバーする薄い膜を取り除きます。
    3. pynに接続されている幽門の小さなセクションを、カットすることでpynを分離します。
    4. 優しく幽門セクションを持ち上げて、あなたがPDNに接続する分岐に到達するまでpynのいずれかの側に組織を切り取る。
  6. PDNを分離する。
    1. PDNを見つけ、それが幽門散大筋に後方に移動する神経です。
    2. PDNに接続されている幽門散大筋の小さなセクションを、カット。
    3. 優しく、幽門散大筋のセクションを持ち上げて、pynに接続する分岐に到達するまで、PDNのいずれかの側に組織を切り取る。
  7. LVNにpynとPDNを結ぶ腹LVNを 、分離する。
    1. pynとPDNが腹LVNに接続する三角形の分岐点で、このようなvplnなどの腹側LVNオフ枝、その神経のいずれかの小さなセクションを分離する。これは、腹側LVNを引っ張らないようにハンドルとして使用されます。
    2. ハンドルを持ち上げて、腹LVNの両側に組織を切り取る、あなたがどこにPSN分岐点をオフに到達するまで前方方向に働いて。
  8. 反対側のLVNと後部神経を分離するために13 -手順10を繰り返します。

  9. 胃から口胃神経系を切り離します。
    1. 完全に胃からのLVNを切り離すには、PSNを引っ張るとPDNとpynを除いて、LVNと腹LVNに接続されているすべての組織や神経を切る。反対側にこのプロセスを繰り返します。
    2. 各MVNの外側端をカット。外側の端を持ち上げて、神経と下層胃組織の間に余分な添付ファイルをカット。
    3. 前端で、交連神経に余分な添付ファイルをカットし、それぞれの側に唇神経を切断。
    4. 視覚的に胃の組織に追加の添付ファイルをカットして識別し、口胃神経系のシステムをスキャンします。
    5. 交連神経節上記の、および胃から口胃神経系剥離、両方交連神経の前端につかむと皿の側面に移動。これを行うとして、神経系を解放するために、残りの添付ファイルをカット。
  10. 小さなSylgard皿を準備します。
    1. 小皿にSylgardの表面に十分にある胃の組織をこする。これは、生理食塩水は、皿に均等に分散されるように、Sylgardの疎水性を減少します。
    2. 冷やした生理食塩水とSylgard皿をすすぎ、記入してください。
  11. 、両方の交連神経の前方の端をつかんで、大きな皿の神経系を持ち上げ、そして小さな皿にそれを置くことによって準備さSylgard皿に神経系を転送します。

  12. minutenピンとタングステンワイヤから切断薄くピンの組み合わせを使用して、小さな皿にSTNSをピン。
    1. 準備が劣る心室の神経が離れてSylgardから指していることをチェックして背側にアップしていることを確認してください。
    2. 脳を取り出して、交連神経をピン。
    3. ゆっくりと後方と横方向にPSN sのそれぞれを引っ張り、そしてそれらを確保することによりタイトでフラットな神経系を引き出します。
    4. PDN sから幽門散大筋を外し、PDN sをピン
    5. 削除幽門pyn sからセグメント、およびpyn sをピン
    6. このような口唇神経、MVN sとAGN秒として、残りの孤立した神経を突き止める
  13. Desheath STG。
    1. STGはSylgardに対して平らになると横方向のAGNの、前方STNと後部DVNで張り詰めた開催を確認してください。
    2. DVN内の軸索の可視化を可能にするために照明を配置します。
    3. 小さ ​​なピンや細かいタングステン針を使用して、STGにちょうど後部DVNを 、周囲の鞘に小さな浅い穴を作る。
    4. 神経鞘における水平断裂を作成するには、軸索の背側、DVN渡っ針を引き抜きます。
    5. STGへの後方神経鞘のフラップを取得し、STGの背側からシースを除去するために前方に引き出します。
略語：
STNS 口と胃の神経系
STG 口と胃の神経節
COG 交連神経節
STN 口と胃の神経
MVN 内側心室神経
イオン 下食道神経
息子 優れた食道神経
AGN 前胃神経
DVN 背心室神経
LVN 外側心室神経
PSN 後胃の神経
vpln 後腹側外側神経
pyn 幽門神経
PDN 幽門拡張器の神経

ディスカッション

ロブスターの胃とSTNSの解剖学は、よく以前に5,6に記載されており、この解剖の手順のバリエーションが多くの研究に利用されている。我々は、開始前に、解剖に5-7とSTNS 5,8胃の解剖学に精通することをお勧めします。そのような知識が神経や組織への偶発的な損傷のリスクを減少します。

準備の健康を維持するために、それは涼しい温度で準備を維持するために重要です。これは、簡単に生理食塩水を4と30分毎に交換することによって達成される˚C生理食塩水は冷蔵庫で保管。冷生理食塩水に浸漬する場合、孤立STNSの準備は、多くの時間実行可能です。関連ロブスター属のヨコエビの録音は 、in vitro 9 の 5日間を通してSTGから安定したリズム活動を示している。類似の堅牢性は、H.で見られているamericanus（OBS pers.。）。

交連神経節からSTGへの調節の入力は、継続的な運動パターンを維持するために必要です。したがって、正常なリズム活動を維持するために、これらの神経節とイオン 、 息子 、とSTNの神経はそのまま保持されている必要があります。 AGNの（胃ミル（GM）軸索を含む）、MVNの（ラテラル胃（LG）と劣った心臓（IC）軸索を含む）、pyn S：我々が説明する解剖では、いくつかの運動神経を（運動ニューロン軸索を含む）保持（幽門ニューロン（PY）軸索を含む）、PDNの（幽門拡張器（PD）軸索を含む）、とLVNの（ラテラル幽門（LP）、内側胃（MG）、LPGの軸索だけでなく、GMからのものを含む、 PDとPY）。追加の（または別の）神経を解剖することにより、他の運動ニューロンの軸索が記録されることがあります。運動ニューロン軸索のそれぞれの個々のタイプは、ニューロンのプロジェクトの、そのタイプに筋肉を支配する神経から解剖し、記録することによって個々に記録することができる。

この製剤は、神経系の機能に焦点を当てた研究のさまざまな目的で使用されることがあります。ニューロンの活動はsomaの複数形や軸索から細胞内、シャープ電極記録を用いて、または神経から細胞外に電気インパルスを記録することによって、どちらか記録することができる。 STGニューロンの多くのイオンチャネルは、部分的にクローニングされており、mRNAは、手動で引っ張らsomaの複数形10,11から測定することができる。

謝辞

我々は、顧問、博士イヴマーダーに感謝します。この研究は、イブマーダーとNS059255にNS17813 AE T.する健康補助金の国立研究所によってサポートされていました

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
極細タングステン線 (直径0.001 in.)器具California Fine Wire Company1-2mmに切断し、極細ピンとして使用する。
ピンセット #5器具Fine Science Tools91150-20
ミニュテンピン器具Fine Science Tools26002-10
Moriaスプリングシザー (刃長7mm)器具Fine Science Tools15370-52これらは最高級品である。同社からより経済的なスプリングシザーも販売されている。
シャーレ (100x15mm)器具Fisher Scientific08-757-12Sylgard 182を2-4mm充填する。
Sylgard 182その他Dow Corning182
ピンホルダー器具Fine Science Tools26018-17オプション。脱鞘はシザーと極細ピンセットのみで行うことができる。
超極細ピンセット #5SF器具Fine Science Tools11252-00
タングステン針器具Fine Science Tools10130-05オプション。脱鞘はシザーまたは極細タングステン線を切断して作ったピンで行うことができる。
解剖顕微鏡

参考文献

  1. Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
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  9. Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
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  11. Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).

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