方法論記事

ES細胞由来の神経上皮細胞の培養

DOI：

10.3791/118

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2006年11月30日

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1McLean Hospital, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

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間質細胞由来誘導活性（SDIA）を使用して、胚性幹（ES）細胞からの神経上皮前駆体の導出。

要約

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ES細胞は、それらの新しい治療法の開発のための魅力的なツールとなってすべての胚葉から細胞へと分化する能力を持っている。一般的には、ES細胞の分化は、最初に伝播し、成熟した細胞の表現型に分化することができます未熟な前駆細胞を、生成するための概念に従っています。まず、成熟した神経系細胞への未熟な神経上皮前駆体と第二、その分化の導出と拡大：これはまた、神経細胞の開発は二つの主要な手順を次のようする、ES細胞由来の神経分化に適用されます。 ES細胞から神経前駆細胞を製造する一般的な方法は、神経外胚葉を含むすべての胚葉由来の細胞の分化を明らかに胚様体（EB）形成に基づいています。代替と神経上皮細胞の発達を誘導するより効率的な方法は、頭蓋骨の骨髄由来のストローマ細胞（1）と共培養ES細胞によって達成することができる間質細胞由来誘導活性（SDIA）を、使用しています。両方とも、EBの形成とSDIA、神経管、および/または神経堤のような前駆細胞に似ていると考えられているロゼット様構造、の開発を明らかにする。神経前駆細胞を単離し、拡大し、さらに定義されている培養条件を使用して、特定の神経細胞とグリア細胞に分化することができます。ここでは、ストローマ細胞株MS5との共培養実験（2-5）のようなロゼットの生成と分離を説明します。

プロトコル

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ステップ1

  1. プレートマイトマイシン- Cのα- MEM培地でゼラチンコート（30分間0.01％）6ウェルプレートに70,000 / cm2の密度でMS5細胞（2.5時間で10μg/ ml）をggrowth的に阻害される。
  2. セルが接続されており、単分子層を（夜の成長以上）に形成しているときは、SRMに切り替える。
  3. 手動で27 ½ G針と注射器を用いてES細胞培養物からES細胞コロニーを分離する。
  4. MS5細胞（6ウェルプレートあたり通常2-3コロニー）で、低密度で1ミリリットル青い先端とプレートで慎重にコロニーをTritrurate。

注：ES細胞は、コラゲナーゼやトリプシンを用いて酵素の伝播から取得することができます。

ステップ2

  1. ロゼットを含むコロニーの形になるまで14-21日のためにMS5フィーダー上にES細胞を成長する。


注：変更のメディアが多い。ロゼットは、植民地と300から500 ng / mlのノギンはSRM（3）に追加されている場合、それらの形成が大幅に向上することができるの外縁部に、通常です。いくつかの分化のプロトコルでは、SRMはN2 -メディアと交換し、セルの仕様（2-5）を促進するための成長や他の要因で補足することができます。

ステップ3

  1. 隔離すると27とのロゼットを選ぶ½ Gの針を顕微鏡下で。

注意：MS5間質細胞を切断し、検出を避けます。コロニーはロゼットでパックされている場合、人はまた全体のコロニーを分離することができます。


ステップ4

  1. ロゼットのクラスタを吸引、ポリ- L -オルニチン（0.001％）とフィブロネクチン（1μg/ mlの）またはラミニン（1μg/ ml）をコートした6ウェルの上に1ミリリットルブルーチップ、プレート一緒に慎重にそれらをtritrurate N2 -通常のbFGF（20 ng / ml）を補充したメディア。ロゼットは、改革と拡大していきます。

注：細胞の生存を向上させるためには、プレート滴の小さなクラスターは細胞密度を増加させることができる。このステップは、セルの仕様（2-5）を促進するために追加の成長や他の要因とN2 -メディアを補完することによって変更することができます。

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ディスカッション

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このプロトコルは、SDIAを用いてヒトES細胞から神経上皮細胞を生成し、分離の別の手順を示しています。この方法の応用は多様であり、（例えば1、2、5-9）指定された神経細胞を生成するために多くのプロトコルで使用されています。ロゼットは前方表現型（2、5、10）と神経管の細胞に似たとも神経堤の前駆細胞（11、12）が含まれると考えられている。それらが定義されている培養条件における固有の要因によってパターニングすることができるので、さらに、彼らは、可塑性の一定水準を維持する。このように、SDIA由来の神経前駆細胞は、それらのES細胞の分化のパラダイムの異なる神経細胞集団の導出のための有用なツールとなって中枢および末梢神経系から多くの細胞型を生じさせることができる。

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開示事項

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著者に開示すべき事項はありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
L-グルタミンGIBCO（Life Technologies社）25030
$\alpha$-MEMGIBCO (Life Technologies社製)12571
ペニシリン/ストレプトマイシンGIBCO, Life Technologies社製15140
ノックアウトDMEMGIBCO, Life Technologies社製10829
ノックアウト血清代替物Life Technologies社製GIBCO10828
MEM非必須アミノ酸溶液GIBCO, Life Technologies社製12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
N2-Aサプリメント幹細胞技術07152
マイトマイシンCSigma-AldrichM0503
ゼラチンタイプASigma-AldrichG1890
ポリ-L-オルニチンSigma-AldrichP49570.01%溶液
ラミニンSigma-AldrichL-2020
フィブロネクチンSigma-AldrichF2006
塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)Invitrogen13256
27.5G針付き1 mLシリンジBD Biosciences309623
N2-A培地培地DMEM/F12 + 1% N2-Aサプリメント
血清代替培地 (SRM)培地Knockout-DMEM + 20% Knockout血清代替物 + 1% MEM非必須アミノ酸溶液 + 2 mM L-グルタミン
α-MEM培地培地α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-グルタミン + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン
MS5細胞株ストローマ細胞
顕微鏡
6ウェルプレート組織培養用

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
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