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方法論記事

ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

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DOI:

10.3791/1182

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2009年3月20日

 ,  ,  , 
1Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA), 2Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Instituto Tecnologia Química e Biológica UNL, Av. da República

この記事について

サマリー

cDNAマイクロアレイPtGen2は、テーダマツの遺伝子発現研究のために開発されました P. taeda、および他の針葉樹種。ここで、我々は、事前に、より良い一貫性をもたらすためにこの配列で使用できるテクニックを処理し、洗浄後、ハイブリダイゼーション、削減の成果物、および低バックグラウンドを示す。

要約

PtGen2は増幅さテーダマツのESTを含む26496機能cDNAマイクロアレイです。配列は、松や他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者による使用のために我々の研究室で生産されている。 PtGen2は、テーダマツにおける私たちの遺伝子の発見の努力の結果として開発され、主に根の組織からだけでなく、針と幹から同定された配列で構成されています。1,2 PtGen2は異なるのCy -色素標識された針葉樹のターゲットcDNAをハイブリダイズすることによりテストされています、増幅および間接標識法を非増幅し、また、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の数とテストの両方を使用する。このビデオでは、以前に開発された手続きに多少の変更を使用して、プレハイブリダイゼーション前後だけでなく、ハイブリダイゼーション後のスライドの取り扱いおよび処理に焦点を当てています。3,4また、発電に使用されるプロトコルである、テキスト形式でのみ、付属のラベリングとターゲットcDNAのsのクリーンアップだけでなく、ソフトウェアの詳細については、ダウンストリームデータ処理のために使用。

PtGen2は完全に除去することが困難な場合も塩の高濃度が含まれている独自のプリントバッファに出力されます。スライドは、プレハイブリダイゼーションの前に暖かいSDS溶液で最初に洗浄されています。プレハイブリダイゼーション後、スライドは、残りの塩の除去を完了するために水のいくつかの変化に積極的に洗浄されています。 LifterSlips™は、その後洗浄し、スライド上に配置し、標識cDNAされるかは、慎重にスライド全体のサンプルを均等に分散のために提供する毛細管現象の方法によりマイクロアレイ上に装填し、気泡の取り込みの可能性を減少させる。配列へのターゲットのハイブリダイゼーションは48℃で高湿度の条件で行われます。ハイブリダイゼーションの後、標準的な一連の洗浄は53℃の拡張時間のためのCおよび室温で行われている。このテクニックを使用して処理PtGen2スライドは、塩と、配列が少ない厳密に処理されるときにしばしば見られるSDS -由来のアーチファクトを低減します。いくつかの異なる針葉樹RNAのソースから派生したターゲットをハイブリダイズする、この処理のプロトコルは、より少ないアーティファクト、減少の背景を生み出し、そして配列の異なる実験群間でより良い整合性を提供する。

プロトコル

（セクション1注 - 4ビデオでは分かりませんが）

CY -標識された標的cDNAを準備

以下は、我々はハイブリダイゼーションをマイクロアレイに前テーダマツの全RNAおよび間接的なcDNAラベリングからcDNA合成に使用するプロトコルです。いくつかの非自明な修正が行われているが、以下のプロトコールは、Invitrogenのスーパースクリプト間接cDNAラベリングキットに付属の取扱説明書と同様である。

パート1：ファーストストランドcDNA合成反応

  1. 混和後、使用前に各キットのコンポーネントを回転させる。
  2. 次のように反応を準備します。
    • XμlDEPC - H 2 O
    • XμlトータルRNAを、20μgの/反応（AmbionのターボDNaseで前処理）
    • 2μlのアンカーオリゴ（dT）20プライマー（2.5μg/μl）
    • 1μlのランダムヘキサマープライマー
    • 合計量=18μl
  3. 70でチューブをインキュベートしますその後5分間、1〜2分間氷上で場所を。
  4. 氷上で各反応チューブに以下を追加します。
    • 6μl5Xファーストストランドバッファー
    • 1.5μlずつ0.1M DTT
    • 1.5μlずつ10mMのdNTPミックス
    • 1μlのRNaseOUT（40U/μl）
    • 2μlのスーパースクリプトIII RT（400U/μl）
  5. 穏やかに混合し、手短にスピン。 45一晩チューブをインキュベート℃を
  6. 各反応チューブに1M NaOHを15μlを加えてよく混ぜる。
  7. 10分間70℃でチューブをインキュベートします。
  8. 1MのHCl15μlを加えます。穏やかに混合する。
  9. 20μlの3M酢酸ナトリウム（pH 5.2）を追加し、穏やかに混合する。

パート2：浄化1stストランドcDNA。

  1. （ステップ1.9から）のcDNAへのローディングバッファー500μLを加え、よく混ぜる。
  2. コレクションチューブにSNAP精製カラムを（間接標識キットに付属）を配置し、カラム上でcDNAを読み込みます。
  3. 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。
  4. 同じコレクションチューブにSNAPカラムをセットし、洗浄バッファーの500μLを加える。
  5. 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。
  6. three500μL洗浄の合計については、ステップ2.4​​および2.5を3回繰り返します。
  7. 1分秒間、室温、14,000 gで複数の時間をスピン、フロースルーを捨てる。
  8. 新しい1.5mlチューブにSNAP Columnを置きます。
  9. SNAPカラムと1分間室温でインキュベート列に暖かいDEPC -水（50℃）50μlのを追加。 1分間室温、14,000 gでスピンを経由してcDNAを溶出します。
  10. DEPC -水暖かい100μlの溶出液に対して同じ1.5mlチューブを使用して、ステップ2.9を繰り返します。
  11. ステップ2.9および2.10から溶離液に3M酢酸ナトリウム（pH 5.2）の20μlのを追加。
  12. チューブとミックスにグリコーゲンの3μl（20mg/ml）を追加します。
  13. 、氷冷100％エタノールの500μLを追加しよく混合し、-80℃で1時間チューブをインキュベート℃に
  14. 4、14,000 gでチューブをスピン℃で20分間。注意深く上清を取り除く。
  15. 氷冷70％エタノールの500μLを追加し、4、14,000 gでチューブを回転℃で5分間。注意深く上清を取り除く。
  16. 5分間のサンプルを空気乾燥させる、すべてのエタノールが削除されていることを確認してください。
  17. 5分間37℃でCを2Xカップリングバッファーを温め、暖かい2Xカップリングバッファー5μlのでcDNAサンプルを再懸濁する。
  18. 50℃のcDNA /カップリングバッファを加熱℃で10分間と渦のためのCも。のcDNAペレットが完全に2Xカップリングバッファーに再懸濁していることを確認してください。

パート3：蛍光色素で標識

反応を準備する際に、光への色素溶液の曝露を最小限に抑えるように注意してください。また、DMSOは吸湿性であり、色素のNHSエステルと反応し、大幅にカップリング反応の効率を低下させる空気から水分を吸収します。 -20℃でアンバースクリューキャップバイアルのキットに同梱されているDMSOを維持し、結露を防ぐために開く前に室温にバイアルを暖かくしましょう。このキットで提供される唯一のDMSOを使用してください。

  1. のCy - 3またはCy - 5色素の1つのパケットを開き、色素バイアルに直接DMSOの75μlを加える。
  2. ステップ2.18からチューブにDMSO /色素溶液の5μlのを追加。
  3. よく混和して、1時間暗所で室温でチューブをインキュベートする。
  4. 色素結合cDNA溶液に3M酢酸ナトリウムの20μlの液（pH 5.2）を追加します。
  5. cDNA溶液にローディングバッファー500μLを追加。ボルテックスでよく混ぜる。
  6. 明確なコレクションチューブにSNAP列を配置し、cDNA /バッファのソリューションを読み込みます。
  7. 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。
  8. 同じコレクションでSNAPカラムを配置チューブ、カラムにWash Bufferを500μLを加える。
  9. 1分間、室温、14,000 gでスピン、フロースルーを捨てる。
  10. ステップ3を繰り返します。 8〜3.9 3つの3500μL洗浄の合計回数、。
  11. 1分間、室温、14,000 gで複数の時間をスピン、フロースルーを捨てる。
  12. 新しいオレンジ色のコレクションチューブにSNAP Columnを置きます。
  13. 室温で1分間SNAPカラムとインキュベートする暖かいDEPC -水（50℃）の65μlを追加。
  14. 1分間、室温、14,000 gでスピンし、フロースルーを収集する。フロースルーは、あなたの精製されたcDNAの色素結合の60μlが含まれている必要があります。

パート4：標識手順の評価。

  1. 各CY - cDNAラベリングを評価するための分光光度計の検定を行う。合成されたcDNAのpmolの合計数を計算：[OD 260 ×巻。 X37ng/μl× 10 3 ngの/ PG] / 324.5 PG / pmolの。各標識反応のために法人のCy -色素の合計pmolのを計算する：ピコモルのCy3 = [OD 550 X巻] / 0.15; pmolのCy5と= [OD 650 X巻] / 0.25。次に、各反応の塩基/ pmolの色素比のpmolを計算する。最適な反応はCy -色素（60ulあたり）のcDNA（あたり60ul）、> 200pmol、および<30であるヌクレオチド/染料比の> 6000pmolを生成します。

パート5：スライドプレウォッシュ

  1. PtGen2配列は、コーニングUltraGapsスライド（アミノシランコートされた）に印刷されており、cDNAは、UVクロスリンクされています。プリントスポットが原因でバッファの高塩分にはっきりと見える。
  2. 印刷領域（オプション）の上部と下部の領域のためのスライドをマークするためにダイヤモンドチップのペンを使用してください。
  3. 顕微鏡のスライドの洗浄ディッシュ（3"× 4"）に約250ミリリットル43〜予め温めておいた° C 0.2％SDS溶液を置く。
  4. 場所は、スライド上に塩を除去するために15〜20倍、非常に精力的にSDSの溶液中にスライドラックとプランジでプレハイブリダイズされるまでスライドさせます。
  5. 鉗子を使用すると、慎重にラックからスライドを削除し、43℃にあらかじめ温めておいたれているプレハイブリダイゼーションバッファー（5 × SSC、0.1％SDS、1％BSA）を含むコプリンジャーの中に置いてください少なくとも1時間、43℃でインキュベートする。

第6部：プレハイブリダイゼーション

  1. fiveスライド皿を洗う、millipureのdH 2 Oで満たさそれぞれ、および分子等級イソプロパノールを充填した1コプリンジャーを設定します。スライドラックにスライドを配置し、20回、それぞれのダンクで5皿を順次処理します。
  2. 第五水洗浄から一度に2つのスライドと微量にスライドのイソプロパノールとすぐに場所（Chipmateのベンチトップ、2箇所）に5〜6回をディップして乾燥するために1分間の回転を削除します。
  3. 圧縮空気ときれいなスライドでは、0.22μmのフィルターカートリッジで濾過し、ゲノムソリューションのハイブリダイゼーションチャンバーに上向きにバーコードでそれらを置きます。
  4. クリーンLifterSlips™濾過空気とし、下向きに白いストリップでスライド上に配置する。軽くスライド上のリフタースリップを合わせるために黄色のピペットチップを使用（LifterSlipsを洗濯™70％エタノールで最初のオプションです。我々はそれが不要であることが判明しました。）

パート7：ハイブリダイゼーション

暗い場所や暗い場所で行われるべきである。

  1. ハイブリダイズする各スライドの場合は、各ターゲットの50 - 75pmolを与えるために標識cDNAのCy - 5、CY - 3の量を計算する。 37〜45で一本のチューブにそれらの額を結合し、熱セットで真空デシケータで乾燥℃の完全に乾燥しないでください！
  2. 60mlのハイブリダイゼーション緩衝液（新鮮なその日作られた）と渦短時間で乾燥させたプローブを再懸濁します。
  3. 30秒間95℃、入浴して、迅速に微量で5分間再懸濁されたcDNAをインキュベートする。
  4. ゆっくりとスライドの下部にあるスライドLifterSlip™ジャンクショ​​ン（バーコードの末尾）でピペッティングすることにより全体の再懸濁したプローブのボリュームをロードする。スライドは、毛細管現象を介してロードされます。 （いくつかのスライドにピペッティングしてから、優しくLifterSlipをオーバーレイ™これは、泡を取得する場合に、スミアのアーティファクトを発見につながることができる配置後LifterSlip™を移動できないので、ワンショット法であることを好む）
  5. ウェルチャンバーの両端に位置する各湿度に100mMのDTTの2​​0uL場所。
  6. チャンバーの上部に配置し、カムネジを締めます。 50〜60 rpmでおだやかに振とうしながら12〜18時間では48℃の水浴にアルミ箔と浸すとチャンバーカバー。

パート8：ポストハイブリダイゼーションの洗浄

すべての洗浄は、暗いまたは暗い場所で行われるべきである。スライドは最後のステップまで、乾燥させてはいけません。

  1. 1）W：Wash Solutionを＃1 @ 53以下のそれぞれの250ミリリットルで満たさ° C、および4つのスライドの洗浄皿を充填した1コプリンジャーを設定する灰の解決策＃1 @ 53 ° C、2）洗浄液＃2 @室温、3＆4）のWash Solution＃3 @室温を含む二つの皿。
  2. 慎重にハイブリダイゼーションチャンバーからスライドを削除し、コプリンジャーに一度、それら2つを置く。 30秒に向けて出発、その後徐々にスライドを持ち上げ、リフタースリップは、瓶のままになります。のWash Solution＃1（1X SSC、0.2％SDS、予熱から43 ° C）に直ちに浸漬場所のスライドラックのスライドと。すべてLifterSlipsが削除されており、すべてのスライドを洗浄するまでのWash Solution＃1皿になって繰り返します。 10回精力的に上下にラックを突き通す。
  3. 53場所の皿℃で10分間50〜100 rpmで振盪しながら空気シェーカーでC。
  4. 、＃2（0.1 × SSC、0.2％SDS）をソリューションを洗浄するためにラックを転送プランジ10回、そして室温でインキュベート、10分間振とう遅い。
  5. 15倍の残留SDSは、Wash Solutionを＃2からのキャリーオーバーを削除する最初のWash Solution＃3（0.1 × SSC）にディップラック。第二のWash Solutionの場所のラック＃3皿、プランジ10回後、10分間振とう遅い。
  6. 50mLのファルコンキャップチューブとスイングバケットローターを装備した遠心機でスピン@ 1,500 rpmでの場所のスライド。防音コンテナを明るみにスライドを削除する、我々はアルミ箔で覆い、別のファルコンチューブを使用し、窒素ガスと管からパージ空気、キャップきつく（オゾンレベルが高いとき、これは夏に特にCy色素、CY - 5の酸化を低減）。スライドは、前の窒素パージ管の走査に数時間保存できます。スキャンを洗浄した直後に行われる場合しかし、最良の信号の結果が得られます。

パート9：データ収集と統計解析

  1. パーキンエルマーのScanArrayで収集された画像データをスキャンします。我々は、10ミクロンのスキャン設定とバランス、製造元の指示に従って、ラインの調整法を用いてCy3とCy5のシグナルを使用してください。
  2. TIFファイルは、ImaGeneバージョン7.5（BioDiscovery、（株）、エルセグンド、カリフォルニア州）で収集し、フィルタリングされたグリッドと生の信号のデータです。
  3. データの正規化と統計的に有効な発現の異なる種を決定する評価はBRB配列ツールバージョンを使用して行われます。 3.7。
  4. 協調的発現遺伝子の定量を容易にするために、パターン分析は、遺伝子発現パターンの解析ソフトウェア（GEPAS）版を使って行われます。 3.1。

figure-protocol-1

図1このprotoco L.を使用して処理PtGen2配列の例

figure-protocol-2

図2。PtGen2配列の例は、標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールを使用して処理。

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ディスカッション

PtGen2は、テーダマツの研究コミュニティで主に使用するように設計されて最近開発された、カスタムcDNAマイクロアレイです。これまでに生成された予備的な結果は、我々が持っている乾燥ストレスに応答して発生する転写事象の評価に有用なツールであることが配列を示すだけでなく、海岸松の胚発生中に発生した変更を監視するには、 マツカイガンショウ 5,6きたまた、最近よくクロス種のハイブリダイゼーションにおけるPtGen2作品が針葉樹の属の多様な範囲から分離されたターゲットのサンプルを使用していることを示した。5 PtGen2は、より多くのアカマツと他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者によって利用されるにつれ、このトレーニングビデオが必要とそれらを提供する必要があります品質と再現性のあるデータを生成するための技術基盤。一般的にマイクロアレイの作業に用いられるものよりも厳しいハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコルによって処理されるときに私たちの手で、PtGen2は良い結果が得られた。 PtGen2配列を処理する他のアプローチは成功して、一貫性を欠いていた。ここで...

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謝辞

ラベリング、ハイブリダイゼーション、および洗浄プロトコールは、ここにゲノム研究所（TIGR）の間、博士J.クアッケンブッシュが以前に開発されたものに若干の変更、ヴァンダービルトマイクロアレイ共有リソース（VMSR）、博士博士ショーンレヴィが含まれていますロブアルバボイストンプソン研究所、（BTI）コーネル大学在学中。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ハイブリダイゼーション前バッファー緩衝液5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA
ハイブリダイゼーションバッファー緩衝液30% フォルムアミド、5X SSC、5X Denhardt液’s、1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF)、0.1% SDS
洗浄液 #1緩衝液1X SSC、0.2% SDS、43℃に予熱°C
洗浄液 #2緩衝液0.1X SSC, 0.2% SDS
洗浄液 #3緩衝液0.1X SSC
イソプロピルアルコール試薬Sigma-Aldrich34959-2.5L
50mLコニカルチューブその他Falcon BD352070
15mLコニカルチューブその他Falcon BD352196遠心分離中、各50mLコニカルチューブの底部にこのキャップまたは同様のキャップを装着して使用してください。
コプリンジャーWheaton900520
染色皿 &ラック その他Wheaton900200
牛血清アルブミン (BSA)その他Sigma-AldrichA-9418
PolyA RNAInvitrogenPOLYA.GF
SuperScriptTM 間接的cDNAラベル化 キットInvitrogenL1014-02
Turbo DNaseキットAmbionAM1907
システム
Cy-5 染料試薬GE HealthcarePA25001
Cy-3色素試薬GE HealthcarePA23001
リフタースリップ™その他エリーサイエンティフィック25X601
ハイブリダイゼーションチャンバー装置・器具GeneMachinesJHYB200003

参考文献

  1. Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
  2. Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
  3. Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
  4. Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
  5. Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
  6. Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).

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