ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

Summary

cDNAマイクロアレイPtGen2は、テーダマツの遺伝子発現研究のために開発されました P. taeda、および他の針葉樹種。ここで、我々は、事前に、より良い一貫性をもたらすためにこの配列で使用できるテクニックを処理し、洗浄後、ハイブリダイゼーション、削減の成果物、および低バックグラウンドを示す。

Abstract

PtGen2は増幅さテーダマツのESTを含む26496機能cDNAマイクロアレイです。配列は、松や他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者による使用のために我々の研究室で生産されている。 PtGen2は、テーダマツにおける私たちの遺伝子の発見の努力の結果として開発され、主に根の組織からだけでなく、針と幹から同定された配列で構成されています^。1,2 PtGen2は異なるのCy -色素標識された針葉樹のターゲットcDNAをハイブリダイズすることによりテストされています、増幅および間接標識法を非増幅し、また、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の数とテストの両方を使用する。このビデオでは、以前に開発された手続きに多少の変更を使用して、プレハイブリダイゼーション前後だけでなく、ハイブリダイゼーション後のスライドの取り扱いおよび処理に焦点を当てています^。3,4また、発電に使用されるプロトコルである、テキスト形式でのみ、付属のラベリングとターゲットcDNAのsのクリーンアップだけでなく、ソフトウェアの詳細については、ダウンストリームデータ処理のために使用。

PtGen2は完全に除去することが困難な場合も塩の高濃度が含まれている独自のプリントバッファに出力されます。スライドは、プレハイブリダイゼーションの前に暖かいSDS溶液で最初に洗浄されています。プレハイブリダイゼーション後、スライドは、残りの塩の除去を完了するために水のいくつかの変化に積極的に洗浄されています。 LifterSlips™は、その後洗浄し、スライド上に配置し、標識cDNAされるかは、慎重にスライド全体のサンプルを均等に分散のために提供する毛細管現象の方法によりマイクロアレイ上に装填し、気泡の取り込みの可能性を減少させる。配列へのターゲットのハイブリダイゼーションは48℃で高湿度の条件で行われます。ハイブリダイゼーションの後、標準的な一連の洗浄は53℃の拡張時間のためのCおよび室温で行われている。このテクニックを使用して処理PtGen2スライドは、塩と、配列が少ない厳密に処理されるときにしばしば見られるSDS -由来のアーチファクトを低減します。いくつかの異なる針葉樹RNAのソースから派生したターゲットをハイブリダイズする、この処理のプロトコルは、より少ないアーティファクト、減少の背景を生み出し、そして配列の異なる実験群間でより良い整合性を提供する。

Protocol

（セクション1注 - 4ビデオでは分かりませんが）

CY -標識された標的cDNAを準備

以下は、我々はハイブリダイゼーションをマイクロアレイに前テーダマツの全RNAおよび間接的なcDNAラベリングからcDNA合成に使用するプロトコルです。いくつかの非自明な修正が行われているが、以下のプロトコールは、Invitrogenのスーパースクリプト間接cDNAラベリングキットに付属の取扱説明書と同様である。

パート1：ファーストストランドcDNA合成反応

1. 混和後、使用前に各キットのコンポーネントを回転させる。
2. 次のように反応を準備します。
   • XμlDEPC - H ₂ O
   • XμlトータルRNAを、20μgの/反応（AmbionのターボDNaseで前処理）
   • 2μlのアンカーオリゴ_（dT）20プライマー（2.5μg/μl）
   • 1μlのランダムヘキサマープライマー
   • 合計量=18μl
3. 70でチューブをインキュベートしますその後5分間、1〜2分間氷上で場所を。
4. 氷上で各反応チューブに以下を追加....

Discussion

PtGen2は、テーダマツの研究コミュニティで主に使用するように設計されて最近開発された、カスタムcDNAマイクロアレイです。これまでに生成された予備的な結果は、我々が持っている乾燥ストレスに応答して発生する転写事象の評価に有用なツールであることが配列を示すだけでなく、海岸松の胚発生中に発生した変更を監視するには、 マツカイガンショウ ^5,6きたまた、最近よくクロス種のハイブリダイゼーションにおけるPtGen2作品が針葉樹の属の多様な範囲から分離されたターゲットのサンプルを使用していることを示した^。5 PtGen2は、より多くのアカマツと他の針葉樹種で遺伝子発現を研究する研究者によって利用されるにつれ、このトレーニングビデオが必要とそれらを提供する必要があります品質と再現性のあるデータを生成するための技術基盤。一般的にマイクロアレイの作業に用いられるものよりも厳しいハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコルによって処理されるときに私たちの手で、PtGen2は良い結果が得られた。 PtGen2配列を処理する他のアプローチは成功して、一貫性を欠いていた。ここで.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
プレハイブリダイゼーションバッファー	バッファー			5X SSC、0.1% SDS、1% BSA
ハイブリダイゼーションバッファー				バッファー 30% ホルムアミド、5X SSC、5X Denhardt's、1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF)、0.1% SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC、0.2% SDS、43° に予熱;C
洗浄液 #2	バッファー			0.1X SSC, 0.2% SDS
洗浄液 #3	バッファー			0.1X SSC
イソプロピルアルコール	試薬	Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL コニカルチューブ	その他	Falcon BD	352070
15mL コニカルチューブ	その他の	Falcon BD	352196	遠心分離中に各50mLコニカルチューブの底に配置されたこのキャップまたは同様のキャップを使用してください
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish &ラック	その他	ウィートン	900200
アルブミン ウシ血清 (BSA)	その他	シグマ・アルドリッチ	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM 間接 cDNA ラベリング	キット	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	キット	Ambion	AM1907
System
Cy-5 色素	試薬	GE Healthcare	PA25001
Cy-3 色素	試薬	GE Healthcare	PA23001
リフタースリップ™	その他の	エリーサイエンティフィック	25X601
HybChambers	機器	GeneMachines	JHYB200003