共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

1。インジェクションのmRNAの準備

1. この手順で使用されているmRNAがコードするプラスミドCAAX - EGFP（memGFP）mRNAから転写される。最初Gutzmanら、2008によるとプラスミドを線形化する。
2. その後mMessage mMachineキットを使用してmemGFP mRNAを転写。
3. -801μg/μl、分注し、およびストアに得られたmRNAを希釈℃を
4. 一つの細胞の段階で胚の幅は、レーンと1％アガロースの射出成形金型を準備します。
5. 注射の前日に、女性から男性を分離交尾ケージを設定します。
6. 注射の日に、注射の準備をマイクロピペットプラーを使用してキャピラリー針を引き抜きます。

2。 mRNAを注入

1. 注射の日に、氷上に1μg/μlmemGFPのmRNAのアリコートを解凍。
2. 200ng/μlの最終濃度に水でmRNAが1:5に希釈し、氷上に置きます。
3. 200ng/μlで準備memGFPのmRNAの1μlのでキャピラリー針をロードする。
4. ガソリンインジェクターに接続されているマイクロマニピュレータにロードされた針を置きます。
5. 1nlに注入量を調整します。
6. 前日から交配のケージに設定野生型の魚で仕切りを引っ張る。
7. とすぐにそれらが配置されるように胚を収集する。オリエントそれら離れてマイクロマニピュレータの側の単一細胞で胚の培地（ウェスター、1995）でカバーアガロースの射出成形金型インチ
8. 絨毛膜とmRNAは単一のセルに直接堆積されるように、卵黄を介して注入する。実験ごとに約50の胚を注入する。セルが分割されている場合に注入しないでください。
9. 28℃で一晩胚の培地でインキュベートする胚

3。マウントおよびイメージング胚

1. 胚をマウントし、イメージに、興味のある時点の前に実体顕微鏡一時間で胚から鉗子で絨毛膜を除去。
2. 4胚まで取り付けるためのスライドを準備します。
   • 直径約1cm穴を内蔵した特別設計の2ミリメートルの厚さのプラスチック製のスライドの下側にカバースリップを密封するために、シリコーン真空グリースを使用してください。
   • 0.7％アガロースでスライドの穴を埋める、と約20分または硬化するまで放置
   • アガロースが固化した後、それぞれの胚をマウントするに円筒状の穴を形成するために、200μlのピペットチップを使用して、小さなプラグを取り外します。
3. 解剖顕微鏡下でアガロースを充填したスライド上に胚を置きます。胚を麻酔tricaine50μlの（ウェスター、1995）を追加します。
4. 基本的なカバースリップに対する脳や関心領域とアガロースの円筒形の穴に胚を配置するために鉗子を使用してください。
5. シリコン真空グリースで保護された別のカバースリップとアガロースの胚をカバーする。
6. 反転、蛍光灯、レーザー走査型または回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて画像胚を。神経上皮内の単一セルの高解像度の画像を収集するために63x以上で画像。
7. 画像は、LSMソフトウェアからのTIFFファイルとしてエクスポートし、Photoshopを使用して分析している。

4。代表的な結果/成果

図1に示すように、中脳と後脳の心室の間に24 HPFのゼブラフィッシュの神経上皮の代表的な共焦点画像です。各セルは、膜結合型GFPで標識されている。

図1。 memGFP注入24 HPFのゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングを生きる。
GFPによる概説、各セルで24 HPFの胚の（A）神経上皮。地域撮像さは中脳後脳境界を形成し、中脳と後脳の脳室（M、Hはそれぞれ）を分離。

In this video, we demonstrate a method for mRNA injection into single cell zebrafish embryos. Here, we use mRNA encoding a membrane-targeted GFP to label each cell. We then demonstrate how to mount and image the developing brain at single cell resolution. This technique has allowed us to study a novel type of cell shape change, basal constriction, required for formation of the midbrain-hindbrain boundary (Gutzman et al, 2008). Similar analysis of other phenomena has the potential to significantly expand our understanding of vertebrate morphogenesis and the underlying cell biology.