このビデオでは、我々は内部全反射蛍光（全反射）顕微鏡を使用して金魚網膜双極細胞における単一シナプス小胞のエキソサイトーシスと人身売買にラベルを付けたり、視覚化する方法を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、ガラスなどの高屈折率物質に最も近い蛍光分子の選択的なイメージングによって、細胞膜で発生するイベントの調査を可能にする技術です。
プロトコル
パート1：解剖と双極細胞の分離
- 表2に記載されているソリューションを準備し、着信音"（外部）溶液のpHはNaOHで7.4に調整する必要があると内部の溶液のpHをCsOHを7.2に調整する必要があります。アルミ箔で光から内部ソリューションを保護し、4℃に保管してください° Cを使用するまで。
- 解剖前に少なくとも30分間金魚を暗適応;
- （;シグマ、セントルイス、MO低Ca 2 +リンゲルのV型ヒアルロニダーゼ、1100単位/ mL）とL -システイン（0.5 mg / mLと10 mLの動物は、暗順応しながら、ヒアルロニダーゼの5 mLを準備する低いのCa 2 +リンゲル）ソリューションとパパイン（凍結乾燥粉末、40単位/ mL秤量、消化液の5mLのためのシグマ、セントルイス、MO）;
- 手術用はさみで素早く斬首によって金魚を安楽死させると＃11手術用メスの刃を持つ脳と脊髄を破壊する。
- ＃7湾曲デュモンの鉗子の助けを借りて、余分な眼の筋肉を破壊し、アイリスハサミで視神経を切断することにより目を削除します。
- ろ紙と穿刺＃11手術用メスの刃の先端と強膜の縁の部分の上に置いて片方の目の電球。
- パンクした全体の内部vannasのはさみの刃を紹介し、離れて全体の前眼部をカット。
- 残りの眼杯の上にろ紙の小片を置き、紙の硝子体液を浴びてもらうために、いくつかの圧....
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ディスカッション
客観型全反射顕微鏡の利点は、1）それはそれによって焦点のずれた光を最小限に抑え、目的の焦点面内に狭い領域に励起光を制限することにより、優れた光学セクショニングを提供することであり、2）光が距離と共に指数関数的に低下するので、 、垂直方向の移動は、蛍光強度の変化としてモニターすることができる、高開口数の対物1,5〜3）効率的な集光。
技法の主な欠点は、それが電子顕微鏡の超薄のセクションとほぼ同じである細胞表面、100＆nmの内部で何が起こっイメージングイベントに制限されていることです。したがって、これらのイベントの可視化は、しっかりとガラスに接着されている細胞で、ガラスに付着した膜のパッチに近いシナプスリボンの存在にし、小胞のロードが成功に決定的に依存する。我々のプロトコルは、双極細胞シナプス終末2,6内の小胞の総数のわずか1〜2％のローディングを可能にします。とは言うものの、それは我々がイメージすることができるものよりも細胞表面で起こって多くのイベントがあることは明らかである。
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謝辞
この作品は、NIHのグラントEY 14990によってサポートされていました。
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参考文献
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).<....
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