の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

サマリー

電気生理学的記録からショウジョウバエ胚は、開発途上筋肉と神経細胞の電気的特性の分析だけでなく、グルタミン酸作動性神経筋接合部と中央のコリン作動性およびGABA作動性シナプスにおける機能的シナプス形成の特性評価を可能にする。

要約

ショウジョウバエ胚発生と機能的神経科学の両方の研究のための最高の遺伝的モデルです。伝統的に、これらのフィールドは非常に大部分が独立の歴史と科学的なコミュニティと、互いに分離されています。しかし、これらは通常異なる学問分野間のインターフェイスは、神経回路形成の最終段階、機能化学シナプスの機能的電気信号特性と分化の買収の基礎となる発生プログラムです。このインタフェースは、調査のために非常に重要な領域です。 ショウジョウバエでは、機能開発のこれらのフェーズは、胚発生の最後の3分の1の間（25℃）<8時間の期間中に発生します。この後期発達期間が長くタフな、不浸透性の表皮クチクラの堆積により調査に難治性と考えられた。画期的な進歩は、局所的に後期胚の制御解剖を有効にするためにキューティクルに適用できる水重合外科接着剤のアプリケーションでした。背側縦切開で、胚は実験的な調査に腹神経索と体壁の筋肉組織を露出させる、フラットなレイアウトすることができます。ホールセルパッチクランプ法は、個々に識別可能な神経細胞と体細胞の筋から記録するために使用することができる。これらの記録の構成は、イオン電流とニューロンと筋肉の両方の活動電位伝播の外観と成熟を追跡するために使用されています。これらの電気的性質に影響を与える遺伝的変異体はイオンチャネルとそれに関連するシグナル伝達複合体の分子組成を明らかにするために、そして機能的な分化の分子機構の探索を開始するために特徴づけられている。特定の焦点は、中枢神経系と末梢の両方で、シナプス結合のアセンブリとなっています。グルタミン酸作動性神経筋接合部（NMJ）は、光学イメージングと電気生理学的記録の組み合わせに最もアクセスが可能です。ガラス吸引電極は、電圧クランプ筋肉で行われた興奮性接合の電流（EJC）の録音で、末梢神経を刺激するために使用されます。この録音の設定は、シナプスの機能分化をグラフ化し、シナプス前性グルタミン酸放出特性の外観と成熟を追跡するために使用されています。さらに、シナプス後のプロパティは、グルタミン酸受容体のフィールドの外観と成熟を測定するために、筋肉の表面に直接グルタミン酸のイオン導入や圧力のアプリケーションを介して個別に測定することができる。このように、両方の前とシナプス後要素が胚シナプス形成時に個別にまたは組み合わせて監視することができます。このシステムは、大きく胚性シナプス形成を損なうため、シナプスの接続と機能的なシナプス伝達特性の仕様と差別化を支配する分子メカニズムを明らかに遺伝的変異体を分離し、特徴付けるために使用されています。

プロトコル

パート1：設備＆備品

1. ショウジョウバエの胚からの電気生理学的記録は、最初に別のJoveのビデオで説明されている胚の解剖技術、の能力を必要とします。
2. ショウジョウバエの胚からの電気生理学的記録は、標準のパッチクランプ記録の構成を採用しています。他の多くの準備に適したパッチクランプ記録装置とソフトウェアはまた、 ショウジョウバエの胚からの録音に適しています。 ショウジョウバエの胚を解剖時にカバースリップに接着されているため、録音室では、カバースリップを受け入れる必要があります。それはカバースリップに装着される準備と方法の厚さは、優れたDIC光学系と長作動距離レンズと正立顕微鏡を必要とします。
3. 風呂のソリューションの2つのタイプが電気生理学的記録のために使用されている、1）"標準"（月と月、1976a）や"変更された標準"（Broadie、2000）Salinesの、一般的に他の無脊椎動物のシステムでの録音、および2で使用されるソリューションに基づく） "体液のような"（HL）サラン（Stewartら1994）、標準の生理食塩水とショウジョウバエの体液で測定イオン濃度の間の妥協。それは、これらのSalinesのはどれも正確に記録（Broadie、2000）の不利な体液で測定したイオン濃度を、模倣しないことに注意すべきである。標準の生理食塩水は（mMで）含まれています：135塩化ナトリウム、5 KClを、4のMgCl _2、1.8塩化カルシウム、72ショ糖、5 TES、pHは7.2。

パート2：記録の設定

1. 生理学実験のために、解剖胚の準備は小さなプレキシガラスの録音室に置かれている（<0.5 ml）および微分干渉コントラスト（ノマルスキー）光学系と40 - 100X長い作動距離を装着した正立複合顕微鏡で透過光で表示（通常、40X）、水浸対物レンズ（Broadieとベイト、1993a）。録音は、通常、高温で増加する難しさと、（16〜22℃）、室温下加えられた（22 + ° C）。我々は部屋を冷却するのではなく、preapartionを冷却することにより、これを達成する。
2. パッチピペットは、繊維充填ガラスの様々な（例えばホウケイ酸ガラスは1mm外径）から取り出すことができとヒントは、5〜10MΩの最後の抵抗にファイアーポリッシュする必要があります。塩化銀のアース線は、浴中に置かれている。信号は、パッチクランプアンプ（例えばAxopatch - 1D、アクソンインスツルメンツ）を用いて増幅20から10 Hzで8極ベッセルフィルターでろ過し、そしてどちらかのラインでサンプリングしたり、後で分析するため、デジタル保存されています。
3. 従来のパッチクランプ記録は、ほとんどの場合、18 °繊維充填ホウケイ酸ガラス（チップの熱が〜1μmのIDに研磨）から引き出さパッチピペットでCで作られています。現在のレコードは、電圧クランプ（標準保持電位-60〜-80 mVの）（Broadieとベイト、1993a - dで特定された多核の筋線維から作られています;。Broadieら、1997; Fergestadら、1999;。フェザーストーンらは、 、2000）。パッチピペット溶液は（mMで）含まれています：120のKCl、20 KOH、4のMgCl _2、0.25のCaCl _2、5 EGTA、硫酸_{ナトリウム} ATP、36スクロース、および5 TESは、pH7.2で緩衝化。記録電極は、バック充填されています。

パート3：マッスルの記録

1. 原則として、任意の胚の筋肉は、この準備のために記録されることがあります。実際には、ほとんどの記録は、最も内側の筋層（; Broadieとベイト、1993a - Cベイト、1990）に大規模な、腹側長手方向の筋肉に集中している。レコードは、この筋層の背側と外側の筋肉からもなされている（城所と西川、1994;オールドら1995;。西川と城所は、1995;らでバウムガルトナー1996）。しかし、ほとんどの実験は4つの縦、腹側筋群（6,7,12,13）、前腹部（A2 - A3）で、特に筋肉6日に焦点を当てる。
2. いいえ酵素処理は、前の若い胚における筋肉の記録（<16時間AEL）にする必要はありません。しかし、筋肉のシースは、後で胚の発達（> 16時間AEL）およびパッチの記録の前にコラゲナーゼ（コラゲナーゼIV型、二価カチオンを含まない生理食塩水で1 mg / mlの、室温で0.5〜2分）で削除する必要があります。酵素処理に続いて、筋肉のシール抵抗は、一般的に> 1GΩです。
3. パッチクランプ記録は、標準的な技術（; Broadieら1994、1995、1997;。西川と城所、1995 Broadieとベイト1993a - C）の数を使用して、胚性筋肉から行うことができます。任意の標準的パッチクランプのバリエーションは - セルに接続された、インサイドアウト、外部のアウト - 筋肉または隔離された筋肉の膜のパッチで単一チャネル活動を記録するために用いることができる。単一のグルタミン酸受容体のチャネル活性（-60 mVで〜12 Pa）と、一般的に全細胞モードで記録された自発的な興奮性接合部電流（sEJCs）の下降相に観測されています。
4. ほとんどの記録は、全細胞記録の設定で行われます。urationは、わずかな吸引または電気的な"流行"とセルに接続された状態から容易に実現。筋肉は、電圧クランプ（-60〜-80 mVの典型的な保持電位）または電流クランプ構成でどちらからでも記録することができます。若い胚（<13時間AEL）の筋肉を効果的により胚筋管（Broadieとベイト、1993a）の間で大規模なカップリングに電圧クランプすることはできませんが、これは（14 + AEL時間）の発達段階（上田後で中に通常問題ではないと城所、1996）。
5. ニスタチン穿孔パッチクランプ記録は、標準的な全細胞技術（Broadieとベイト、1993a）で得られたレコードを確認するために使用することができます。穿孔のソリューションは、次のように行われます：10mgのプルロニックF - 127（Molecular Probes社のp - 1572）20ミリリットルのDMSOに溶解し、10mgのナイスタチンは在庫を確認するために、この溶液に溶解。株式の100μlをレコーディングソリューションを作るためにピペット溶液をフィルタリング5mlに追加されます。全細胞の電流は、通常は<3分シール形成後に得られる。直列抵抗が著しく、ほとんどの場合、細胞内で増加するとリーク電流の増加を（Broadieとベイト、1993a）を開発することができます。
6. 成熟した胚の全細胞の電位依存性電流（および幼生）筋肉は5つの著名なコンポーネントで構成されています（呉とハウグランド、1985; Zagottaら1988; Broadieとベイト、1993b。）：現在の内側カルシウム（I _Ca）の二速く、不活性化電流、電位依存性（I _A）とカルシウム依存性（I _CF）を含む4つの外向きカリウム電流（角田とSalkoff、1995）、、二つの遅延、非不活性化電流は、電位依存性（I _K）とカルシウム依存性（I _CS）。イオン置換の実験は、電圧クランプ（Broadieとベイト、1993b）の間に細胞全体の応答から、これらの電流を分析するために使用することができます。

パート4：神経筋接合部の刺激と記録

1. NMJの刺激の最も一般的で信頼性の高い方法は、分節末梢神経のガラス吸引電極を使用しています。吸引電極は繊維充填電極のガラスの様々な（1〜1.5μmの外径）から取り出すことができ、ファイアーポリッシュ、目的の設定（〜5μmの内径）を達成する必要があります。適切な分節運動神経の小さなセグメント（<50μm）を密シールを形成する穏やかな吸引ピペットに吸入される。
2. それは、CNSの出口点の近くに神経のループ内で描画することにより、無傷の神経を刺激するのが一般的です。このアプローチは、無傷の準備を簡単に刺激することができますが、自発的なCNSが誘発活性が適用される刺激のパラダイムに重畳発生する可能性があるという欠点を有する。代わりに、カットの運動神経を刺激することです。 CNSが削除される場合は、この手順は、神経を伸ばす傾向にあると損傷を与える可能性があるが、これは、達成することができます。神経も鋭いガラス微小電極で切断し、しかし、この手順では、退屈では困難である可能性があります。それはレコードが無傷の準備から作られることをお勧めします。
3. 刺激は、パラダイムの様々な適用することができます。簡単な刺激（0.2-1ミリ秒）が最適に動作し、刺激強度は、（通常1〜5 V）吸引の構成に依存しますし、実験的に各セルごとに決定する必要があります。運動神経の閾値上刺激は最高の刺激の強さよりわずかに（1から2ボルト）しきい値を設定することによって実現されます。上記のような誘発NMJの応答は、パッチクランプ筋から記録されます。衝撃のアーティファクトが大幅に隔離された仮想グラウンドの使用を減少させることができる。
4. 標準的な吸引電極の神経刺激の少ない信頼性の高い代替は、中枢神経系（西川と城所、1995）の直接的な刺激です。 3-4 MのKCl（またはKAC）を充填した微小電極は、腹側神経節と強度〜2マイクロアンペアと〜持続時間2ミリ秒が配信される（Dietcherら、1998）の正のパルスの途中に挿入されます。電極の先端には刺激が望まれるhemisegment最寄りの神経網にする必要があります。シナプス伝達は、標準構成でのパッチクランプ筋肉に記録されます。
5. 胚NMJはその分化を通してホールセルパッチクランプ記録にアクセス可能です。興奮性接合部電流（EJC）の録音の場合、信号は、（通常1〜2 kHz時）フィルタ処理された、標準的パッチクランプアンプで記録されているアナログからデジタルへのインタフェースを使用してデジタル信号に変換し、使用してコンピュータを取得適切なソフトウェア。

パート5：神経筋接合部の化学と医薬品申請

1. どんな小さな、荷電分子が効果的に胚NMJ（。。Fergestadら1999年、2001年Aravamudanら、1999）にiontophoresedすることができます。イオン導入ピペットは、負または正の電流のパルスを用いて、可変期間のアプリケーションで、特定の構成に引き出すことができます。それは、PU間の漏れを防止するために不可欠です。現在適切な反対バッキングと小売り供給者（Broadieら1993d;。フェザーストーンら2002、2005;。。ロールボーら2007）。このバッキング電流の大きさは、ピペットの構成によって異なりますし、実験的に決定されるべきである。
2. （Broadieとベイト、1993c）、多くの実験は、100mMのストック溶液を（pHは8〜9グルタミン酸ナトリウム塩）を使用して、NMJ神経伝達物質、L -グルタミン酸（月と月、1976b）で行われている。高抵抗イオン導入ピペットは（MΩ100〜200）グルタミン酸受容体（gluR）マッピング（Broadieとベイト、1993d）に使用され、低抵抗のピペット（MΩ20〜50）は合計gluRの応答（Broadieらを推定するために使用されている。 1995、1997;フェザーストーンら2002、2005;。ロールボーら2007）。。負の電流の短パルス（0.1〜1ミリ秒）（〜10 nAのは）漏れを防ぐために、現在の小、肯定的な支持を受けて、うまく機能します。
3. 非課金と荷電分子は圧力の取り出し（FergestadとBroadie、2001;フェザーストーンら2001）によって適用することができます。アプリケーションの場合は、ソリューションが格納されている圧力の取り出しピペット（<5μmの内径）は神経終末から（<10μm）の近くに位置している。イジェクトされるソリューションは、picospritzer（5-10 PSI）や他の加圧空気源（フェザーストーンら、2002）を使用して適用することができます。通常のバスの生理食塩水で - 長期実験中に、録音室（容積<0.5ml）を（0.2ミリリットル/ 0.1秒）継続的に灌流してください。
4. 多くの実験は、シナプス小胞（。。Aravamudan、ら、1999;。Fergestadら、1999;。。フェザー、ら、2000、2002 Broadieら1995）の融合をトリガするために高浸透圧生理食塩水で行われている。他の実験は、グルタミン酸受容体とクロゴケグモの毒を含むlatroinsectotoxin（Broadieら、1995）に対するargiotoxin 636のような毒素、で行われている。

パート6：コンプリメンタリ神経筋接合部バイタルイメージング技術

1. シナプス小胞の動態を蛍光親油性stryl色素（。。ロールボーら2004 FergestadとBroadie、2001）を監視することができる。小胞の分布を直接観察、およびエンドサイトーシスとエキソサイトーシスの速度は測定することができます。いくつかの亜種は、異なる蛍光特性（; FM4 - 64、ローダミンのようなFM1 -​​ 43、フルオレセインのような）で行われている。オリジナルの染料の変更は、変更された疎水性の特性を持つため、別のウォッシュアウトの速度を持つ製品が得られているが、例えば、FM2 - 10解離をはるかに速く膜から。
2. stryl染料と胚NMJにラベルを付けるには、10μMFM1 -​​ 43が上昇した細胞外カリウム（50〜90 mM）の（FergestadとBroadie、2001）を使用して1〜5分のためにロードすることができます。より多くの生理学的アプローチは、神経吸引電極で刺激を介して達成されることがあります。準備は^、+ -フリーバッファ5分間のCa ²で繰り返し洗浄し、蛍光（染めシナプス小胞を表す）を測定して保持されます。エキソサイトーシスを測定するためには、高カリウムや神経電気刺激のいずれかを使用して染料をアンロードすることができます。
3. GFP変異体との融合タンパク質は、胚NMJシナプス（。。Zhangら2002ブランド、1999）の多色ラベリングを可能に生産されている。 GFP -タグ付きタンパク質を発現する多くのトランスジェニックは、一般的な膜のマーカー（例えばmCD8 - GFP）、シナプス後のマーカー（例えばシェーカー- GFP、GluRIIA - GFP）、細胞骨格（例えばアクチン- GFP、モエシン- GFP、チューブリン- GFP）とミトコンドリアを含めて利用可能ですマーカー（例えば、シトクロムC - GFP）とシナプス小胞のマーカー（例えばシナプトブレビン- GFP、シナプトタグミン- GFP;。Zhangら、2002）。
4. 非常に動的であり、発達の機能または変異体表現型（フェザーストーンとBroadie、2000）を評価するために使用することができます。GFPの記者のラベルのコンパートメント漂白して蛍光の回復を観察（FRAP）少なくとも幼虫ショウジョウバエ NMJで、実現可能であることが示されている（Zhangら、2002;。ヤンさんとBroadie、2007）。しかし注意の単語、：これらのマーカーのいくつかは完全にヌル変異を救済しないとさえ正常NMJ生理機能を変更することがあります。

パート7：中央の運動ニューロンからの記録

1. 多くの胚の神経細胞を個別に細胞体の位置と投影の形態（;グッドマンとドウ、1993; Landgrafら1997ベイトとマルティネス - アリア集、1993）に基づいて同定することができます。さらに、GAL4/UASシステム（ブランドとPerrimon、1993）識別可能なニューロン集団（ベインズら、1998）を可視化するためにGFPの発現を対象とすることができます。 4つのモータニューロン（ACCとRP1 - 4）と一つ介在ニューロンPCC（ベインズら、1998、1999、2001;。これまでの記録の研究は、胚の腹側神経索（VNC）内の5つの浅、背側神経細胞のグループに集中している;ロールボーとBroadie、2002;フェザーストーンら1995）。。
2. 同定されたニューロンの細胞体は、ホールセルパッチクランプ記録電極にアクセスできます。 VNC神経線維鞘の鞘が最初にプロテアーゼ（ベインズとベイト、1998年と短い焦点距離の治療で除去する必要があります。ベインズ電子トンら、1999;。ロールボーとBroadie、2002）。背側神経細胞体は0.5〜1％プロテアーゼ（記録の生理食塩水のタイプXIV（シグマ））を含む大口径（〜20μmの）パッチピペットを使用して公開されています。 CNSのシース材は、シースの破裂（フェザーストーンら、1995）まで1-2分ピペットの先端に吸引によって描画されます。録音中に携帯電話のIDを確認するには、ルシファーイエロー（ジカリウム塩、1〜2 mg / mlの）は、細胞の位置と形態を視覚化するためにパッチの溶液に添加することができます。
3. 標準ホールセル電圧及び電流クランプ記録を行うことができます（ロールボーとBroadie、2002;フェザーストーンら、2005。）。外部録音の生理食塩水が含まれる（mMで）：140 NaClを、3のKCl、2のCaCl _2、4のMgCl _2、5 HEPES、10ショ糖、2水酸化ナトリウム液（pH7.2）。パッチのソリューションが含まれている（mMで）：140 K -アセテート、2のMgCl _2、0.1塩化カルシウム、10 HEPES、1.1 EGTA、2 NA2 - ATP、〜6 KOH（pH7.2）に。電圧クランプ記録は、18℃で-60 mVの保持電位で作られています典型的な未調整の安静時の電位が-45〜-65 mVの範囲にある（-52.9 ± 7.5 mVの、± SD、n個= 78を意味する）。
4. 利用可能なアッセイは、電位依存性イオン電流（ベインズとベイト、1998）、反復的な活動電位、シナプスを介した活性とアゴニスト依存性応答（ベインズら、2001）を明らかにする。運動ニューロンへのシナプス入力は、高速のAPを介した高速興奮性シナプス電流（ES細胞）、および分に数回以上を発生する興奮性入力の周期的、持続的な（最大1秒持続時間）のエピソードの両方の形式（ベインズらに記録されています。、1999;ベインズら、2001）。。
5. 細胞体はiontophoretically適用アセチルコリン（ACH）と抑制性伝達物質GABA（。。フェザーストーンら、2005ベインズとベイト、1998）に対応。 ACHは、正の電流によって作動薬のイオントフォレーシスを優先するようにpHを4から5で、DH ₂ 0 100mmのアセチルコリンを含む鋭い微小電極を介して神経細胞体にiontophoretically適用することができます。

代表的な結果

ハリソンら1994;。らでスウィーニー1995;。Rendenら2001;。Huangら2006;腹縦走筋6は、A2 - A3は録音のための最も一般的に利用目標（Broadieとベイト、1993a - dとするセグメントです。 Mohrmannら2008）。成熟胚および孵化したばかりの初齢幼虫（25 AEL 20〜21時間℃=孵化）で、筋肉6セル全体の容量は、発達年齢とともに変化する、典型的MΩ20〜40 25〜30 pFの、と入力抵抗です。ピコアンペアの数十（13〜14時間AEL）から1 -オンリーク（20〜21時間AEL）への最大のNMJシナプス電流の範囲は、急速に年齢の関数として増加。グルタミン酸ゲート電流の直接測定は、孵化直前にピコアンペアの何百もの（13〜14時間AEL）〜1.5 - 4NAの最大応答が得られる。直列抵抗の誤差（合計現在のXの直列抵抗）は、通常<5 mVのですが、成熟した、プリ孵化胚では、10などのように高いかもしれない+ mVのため、直列抵抗の補償が推奨されます。 10月30日μmの平均粒径を持つ胚の筋肉、40〜80μmの平均長さは、ほぼ理想的なスペースのクランプのパラメータを表示するように見える。セルクランプの時定数（R _シリーズ XC _細胞 ）平均0.25未満ミリ秒。

成熟した胚と毛蚕では、背側運動ニューロンの人口は、より限定された記録の対象となっている。神経細胞体の記録は〜5GΩ（;フェザーストーンら、2005ベインズとベイト、1998）の全体の1.8〜2.5 pFの（2.0 pFの平均）の範囲内のセルの静電容量、MΩ40から60の直列抵抗と入力抵抗を明らかにする。これらの細胞は、明らかに胚性成熟時のサイズと複雑になってきており、この成長は、幼虫の開発を通して継続。第三齢期では、細胞全体の容量は、17-20 pFと直列抵抗はMΩ25から37であり、入力抵抗の平均〜900MΩ（ロールボーとBroadie、2002;リチャードベインズ、私信）。イオンコンダクタンスは、開発全体を通して増加するが、電流密度（PA / PF）は非常に一定のままである。成熟した胚では、シナプス電流の平均的な75 - 100pA振幅で、急速なESCのイベントと〜500ミリ秒（ベインズとベイト、1998;フェザーストーンら、2005）を平均化長期電流の両方を持つ。胚では、これらの持続的なイベント分あたり平均3-5は、初齢（リチャードベインズ、私信）に分ごと〜20に増加。 ショウジョウバエのニューロンの形態学的複雑さと膜特性は、非常に細胞の細胞体を超えて適切に電圧クランプにそれは事実上不可能になることに注意してください。一つは、したがって、注意して録音を解釈する必要があります。

ディスカッション

ショウジョウバエの胚からの電気生理学的記録は、マニュアル操作と解剖が必要になります。準備の健康、およびレコーディングの結果としての品質は、迅速かつきちんと記録するための脆弱な胚組織を準備するためにできることつに依存し、実験を実行してください。実験者は、一度に両方に取り組むしようとする前に胚の解剖とパッチクランプ電気生理学の両方を習得している必要があります。

録音は"変更された標準"または"体液のような"（HL）サランのいくつかの種類の一つで行うことができます。これら二つの生理食塩水のクラスの主な相違点は1）のNa ⁺濃度（70 mMのHL対120から135 mMの標準）と2）のMg ^{2 +}濃度（4mMの標準対20 mMのHL）。標準溶液の高いNa ⁺濃度の主な利点は、アクション電位の伝播と、それゆえ、通常の、パターン化されたシナプス伝達の維持管理を容易にするためです。 HL Salinesのは、アクション電位を介したシナプス伝達を抑制する。電位依存性カルシウ...