我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。
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サマリー
要約
このメソッドは、ストレージ/溶解緩衝液で処理し、-80℃でアーカイブされている0.22μmのSterivexフィルターに集中してプランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAを抽出し、塩化セシウムの密度勾配を用いてこのDNAを精製するために使用されます。プロトコルは、細胞からDNAを解放し、RNAを除去する2つの1時間のインキュベーションステップから始まります。次に、フェノールのシリーズ：クロロホルム及びクロロホルム抽出は、抽出液を洗浄し、集中するタンパク質や細胞膜の成分、水溶性のDNA抽出物の収集、およびいくつかのバッファの交換の手順を除去するために遠心分離に続いて実行されます。パート5は、塩化セシウムの密度勾配を経由して任意の精製について説明します。それは混乱を避けるために、プロトコルのダウンタイムを削減するために一度に15未満のサンプルで動作することをお勧めします。このプロトコルに必要な総時間は、抽出するサンプル数に依存します。 10月15日のサンプルと、適切な遠心分離装置が使用可能であると仮定するため、このプロトコル全体では3日かかります。あなたがプロセスの開始時に温度に設定されてハイブリダイゼーションオーブンを持っていることを確認します。
プロトコル
注：このプロトコルで使用されるすべての試薬 は小さな作業にラボのストックから小分けされている株式-これはあなたのDNAサンプルとラボの株式の汚染のクロスコンタミネーションを避けるために非常に重要です。また、ピペッティング時に、クロスコンタミネーションを避けるために、すべての付加のためのピペットチップを変更してください。
パートOne：細胞の溶解および消化
- 氷の上に以前に濃縮されたプランクトンのバイオマスが含まれているSterivexフィルタを融解することによって、このプロトコルを開始します。単純化のために、ここでは個々のフィルタ処理の手順を説明します。実際には、我々は一度に16以下のフィルタ処理をお勧めします。
- 細胞を溶解し、RNAを削除する1つ、そしてタンパク質を分解するためにいずれかのフィルタが融解した後、二つのインキュベーションの最初を開始。第一インキュベーションのため、100μlのリゾチーム（1000μlのTEでの125 mg）を追加し、20mlのリボヌクレアーゼA（10μg/ ml）をフィルターへ。パラフィルムとフィルタを再シールし、37℃でハイブリダイゼーションオーブンで回転させる℃で1時間を残しておく。
- 次のインキュベーションのために、フィルターに100μlのProteinase Kをし、100μlの20％SDSを加える。パラフィルムを使用して、55で、この時間をハイブリダイゼーションオーブンで1時間から2時間以上を回転させるためにそれを残す℃を再シール
- 5cc注射器を使用して、15 mlのFalconチューブにSterivexフィルターからライセートを転送する。 1mlの溶解緩衝液でフィルターをすすぎ、5cc注射器を使用して、ファルコンチューブにライセートに液体リンス追加。今あなたが溶解し、あなたの細胞を消化していることを、あなたはそれらのDNAを抽出する準備が整いました。
パート2：DNA抽出
- 次のステップは、ライセートからDNAを抽出し、フェノール - クロロホルム法を使用することです。クロスコンタミネーションを避けるために、各付加のためのピペットチップを変更することを確認し、溶解液チューブにイソアミルアルコール（IAA）：クロロホルム：等量のフェノール（3ミリリットル程度）を追加します。よく混ぜて10秒間ボルテックス。
- 遠心機のバランスが取れたことを確認し、5分間の2500 gでチューブを回転させる。底部に、フェノール、クロロホルムを含む有機層、および、サンプルからのタンパク質、および水あなたのDNAで構成されて層、、水、およびその他：遠心操作中に、フェノール - クロロホルム - ライセート混合物は、二層に分離する必要があります上には親水性分子、。
- 新しい15 mlのFalconチューブに水層を（あなたのDNAを含む）転送する。ピペットチップ（常に水層を少量残し）とのインタフェースを触れないように注意してください。
- クロスコンタミネーションを避けるために、各付加のためのピペットチップを変更することを確認し、IAA：この新しいチューブに、等量のクロロホルム（約3ML）を追加します。 10秒間ボルテックス。このステップでは、あなたのDNAサンプルから、残りのフェノールを除去するのに役立ちます。
- 水層が透明になるまで5分間、または2,500 gでスピン。新しい、というラベルのファルコンチューブに水層を移し、ピペットチップ（常に背後にある水層の少量を残す）とのインタフェースを触れないように注意して、pH8.0でTEを1 mlを加える。この水層では、あなたのDNA抽出液が含まれています。
パート3：DNAの濃度と洗浄
- 次のステップは、15ミリリットルアミコンウルトラ遠心管にDNAサンプルを洗浄し、集中することです。アミコンチューブは、フロースルーを（ろ液）をキャッチするために、指定された分子量（残留物）とチューブ以上に分子を保持するフィルタで構成されています。この場合、フィルタは、あなたのDNA（濃縮水）を保持します。ステップ2.5からアミコンウルトラチューブのフィルタコンパートメントにあなたのDNA抽出液を移す。
- 10分3500 gでスピン。アミコンフィルターに保持された液体の量の1 mlのあることを確認してください。より多くのリテンテート遺跡、TEと補充フィルターであれば、再度スピン。クロスコンタミネーションを避けるために、すべてのTEを加え、新鮮なピペットチップを使用するようにしてください。
- 別のファルコンチューブに、フロースルー、または濾液を削除し、ゲル上で最終的なDNA産物を確認するまで（第四部）冷蔵庫に保存してください。
- アミコンフィルターに2ミリリットルのTEバッファを追加し、クロスコンタミネーションを避けるために、各TEの添加のために新鮮なピペットチップを使用することを確認しながら、6分間3500 × gでスピン。ステップ3.3からそれと冷蔵庫で保存すると、プールろ過。
- 3回の洗浄（新鮮なピペットの先端を常に使用することを確認すること）の合計2回TEとDNA、及びろ液をそれぞれの時間を節約する（ステップ3.3および3.4に従って）洗ってください。最後の洗浄のために、スピンアミコンフィルターの保持物遺跡の200〜500ミリリットルになるまで。最終容量を記録し、標識1.5mlのエッペンドルフチューブに（あなたのDNAを含む）保持液を移す。
第四部：DNAの品質の決定
- DNAの品質をチェックし、ゲル0.8％アガロースゲルSTA上でサンプルを実行することにより、DNAの濃度を推定一晩1ミリリットルエチジウムブロマイド（反応ステップ）でined。反応ステップ（EtBr -それが既知の変異原物質と疑われる発がん性物質であるを使用する場合は十分に注意してください。頻繁に手袋を変更し、ラボの他の部分へとお肌に流します転送を避けるために確認してください。）として機能するDNAラダー、隣にサンプルをロードサイズと強度の基準（次のステップを参照）。
- 最初のいくつかのレーンでは、様々な分子量と濃度のバンドではしごを読み込みます。最初と最後のレーンの（最も外側の車線）、1キロバイトの50ng/μlの負荷を10μl+または2logラダー：我々は以下の装荷パターンをお勧めします。 50ng/μlλHindIIIのはしごのそれぞれレーン2,3と4、負荷を2μl、5μlの、そして10μlの、、に。最後に、各サンプルの色素とDNAの抽出量が1レーンあたり5μlを読み込みます。
- 約16時間15ボルト（私たちは一晩実行することをお勧めします）でゲルを実行します。
- 翌日、UVゲルドキュメンテーションシステムを使ってゲルを撮影する。あなたのDNAと、その濃度の分子量範囲を決定するために、はしごのバンドにサンプルのバンドを比較する。良質のDNAは高分子量の（> 36KB）持っている、とせん断/劣化の証拠はほとんどが表示されます。図1を参照してください。
第5部：塩化セシウム密度勾配遠心
- DNAの品質が良好な場合と量が十分であれば、塩化セシウム（CsCl密度）勾配遠心分離を行うことによりDNAを精製に進むことができます。この精製ステップはオプションであり、すべてのダウンストリームアプリケーション（たとえば、フォスミドライブラリーを生成する場合には浄化するべきである 、あなたが単にPCR反応を実行する場合、一方、精製は、通常は必要ではない）のために必要ではないことに注意してください。最初に、ラベル、サンプルごとに1つの遠心管。
- 各遠心管に、塩化セシウム、ゲノムDNAの178μlを160 mgを追加。チューブにCsCl及びDNAを添加した後、チューブの上にパラフィルムの小片を配置し、静かに成分を混合するためにチューブを10倍から20倍を反転。 DNAの切断を引き起こす可能性のあるピペッティングで混ぜて使用しないでください。次に、このチューブを10μg/μLの反応ステップの10μlを追加し、同じ方法でそれを混ぜる。 （使用する場合は十分に注意してください流します - それは既知の変異原性物質と疑われる発がん性物質である。しばしば手袋を変更し、ラボの他の部分へとお肌に流します転送を避けるために確認してください。）
- すべてのチューブの重量はチューブ間の体重差が1ミリグラム未満であることなどの遠心分離の前にバランスされていることを確認します。
- ローターを使用して止血剤のチューブを入れ、蓋を閉じて、超遠心機の内部にローターを配置。
- 超遠心機のドアを閉じます。真空は、すぐにドアを閉めるように適用されます。 18時間、100,000 rpmで、20℃で一晩実行
- 遠心分離が完了すると、チューブのラックに止血剤と場所を使用してローターからチューブを取り出してください。
- 青色光トランスでDNAを可視化する、または利用できない場合、暗い部屋で、長波長のUV光を使用してください。 DNAバンドを確認するためにアンバーフィルターのメガネを着用してください。図2を参照してください。
- 滅菌1cc注射器と針を（26G 5 / 8）を使用して、DNAのバンドを削除し、1.5ミリリットルエッペンドルフチューブに入れてください。
- シリンジ内のデッドスペースに閉じ込められたDNAのほとんどを回復するために、100μlのTEでシリンジを洗浄し、チューブにすすぎ液を加える。交差汚染を防ぐために、サンプルあたり100μlのTEバッファーでつのチューブを準備します。
- 、DNAからEtBrを除去チューブに水飽和ブタノールの等量を追加するには、チューブを反転軽く10倍から20倍、1分間10000 rpmで遠心分離し、上部層を捨てる。
- ブタノールの色が透明になるまで3は、洗濯を繰り返す - 4回以上。
- 場所4ミリリットルアミコンウルトラ遠心管のTEとは、上記のDNA溶液を加える。
- DNA量は約100〜500μL（約6〜7分）に減少するまで、室温で3500グラムで遠心し、フロースルーを捨てる。
- アミコンフィルターに2ミリリットルTEを追加し、クロスコンタミネーションを避けるために、それぞれの添加のために新鮮なピペットチップを使用することを確認しながら、6分間3500 gで遠心。二回繰り返します。
- 必要に応じて追加の遠心分離により50〜100μlの最終容量に濃縮し、新しい1.5 mlエッペンドルフチューブにフィルター上のDNA溶液を移す。
- アミコンフィルターに40μlのTEを追加し、残りのDNAを洗浄するために、両方のフィルター膜に沿って上下にピペッティング。 5.15チューブにこの溶液を加える。
- 200μlのオートクレーブに水を加えると7分には、10000 rpmで遠心分離することによってマイクロコンチューブと予備洗浄マイクロコンにマイクロコンYM - 30フィルターユニットを置きます。
- さらにDNAを濃縮するためには5.16からプレウォッシュ加工を施したマイクロコンにDNA溶液を追加。 3分 - 1 5000〜10000グラムで遠心。液体の量を確認してくださいフィルタと繰り返し遠心分離でフィルター上に液体の量は、約50μlに減少されるまで。
- 新しいマイクロコンチューブに逆さまにフィルターユニットを置き、3分間1000gで遠心。濃縮液の理想的な量は50〜60μlです。
- 尺度と光度計でDNAの濃度を記録し（260nmのはず）のピーク品質を確認してください。
- マイナス20℃株式や凍結を操作するためのクリーンなエッペンチューブにDNAの小アリコートを移す。マイナス80の第二クリーンエッペンドルフとフリーズするDNAの残りを転送します。
代表的な結果：
このプロトコルが正しく行われているときは、図1のようなDNAの品質の決定のステップ4.4の後にゲルの画像が表示されるはずです。抽出物の実際のDNA濃度は、サンプルのソースによって異なります。 CsCl密度勾配遠心分離のステップ5.7の後に、青色光で照らされたゲノムDNAは図2のような外観になります。
図1。挿入剤エチジウムブロマイド（10 mg / mlの）で染色した亜寒帯太平洋（重複の）、の4つの深さから採取した高分子量のDNAの0.8％アガロースゲル電気泳動像。ゲルは1 × TBEゲル泳動緩衝で〜16時間のために15Vで実行しました。 10メートルの抽出物は、いくつかのRNAは、（0.5〜2.0 KBの範囲内のスミアを参照）持ち越す保持がサンプルのバンドは（複数のバンドとは対照的に、単一のバンドやしみを示しています）機械的剪断の少し証拠を示す良質のものである。
図2のCsCl勾配遠心分離の後に青色の光に照らされたゲノムDNAのバンド。
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ディスカッション
処理される方法を多くのサンプルであることに応じて、これは2つの1時間のインキュベーションのステップ、と繰り返し洗浄し、遠心分離のステップのために時間を集中的にプロシージャを指定できます。に多くの時間を残すためにこのプロシージャの2つの全体の日を計画するのが最善です。 DNA濃度と洗浄の間に200 -500μLまで減らすためにアミコンチューブの最後の抽出量を得るに問題がある場合は適切な量が残っているようになるまで、（第三部を繰り返す）追加のTEの洗浄と遠心分離を行ってみてください。抽出物は急性クロロホルムの匂いがすればそれは臭いがクロロホルムのすべてが削除されていることを確認するために軽減されるまで、追加の洗浄を行うのが最も良いです。再び、このプロトコルで使用されるすべての試薬は小さな作業にラボのストックから分注している株式 - これはあなたのDNAサンプルとラボの株式の汚染のクロスコンタミネーションを避けるために非常に重要です。また、ピペッティング時に、クロスコンタミネーションを避けるために、すべての付加のためのピペットチップを変更してください。
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謝辞
我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 JJWはNSERCとDAWからの奨学金によって支えられてNSERC、キラムと微生物多様性と進化のための資金を供給センタートゥーラ基礎から奨学金によって支えられている。 SLは、微生物の多様性と進化のためのトゥーラ基礎資金センターによってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 cc シリンジ（26G 5/8 針） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml シリンジ（26G 5/8 針） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml エッペンドルフチューブ | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15mlチューブ | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5ccシリンジ | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4遠心ろ過装置 | EMD Millipore | UFC801096 | 公称分子量分画限界 10,000 |
| ブタノール | Fisher Scientific | A383-1 | 水飽和状態（ブタノール：水 = 1:1）にする。 |
| 遠心分離機ローター、JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| 遠心分離機, Avanti® 日英翻訳 | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| 塩化セシウム | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| クロロホルム：IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| エチジウムブロミド (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| ハイブリダイゼーションオーブン | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| 溶解バッファー | 0.75 M ショ糖, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| リゾチーム | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 1000中に125 mg μl TE |
| マイクロコン® Ultracel YM-30遠心ろ過ユニット | EMD Millipore | 42410 | 50 bp カットオフ |
| パラフィルム | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| フェノール:クロロホルム:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| プロテアーゼK | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| セーフイメージャー™ ブルーライト透過照明装置 | Invitrogen | S37102 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivexフィルター | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| スクロース | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 卓上遠心分離機 | Eppendorf | 5415D | |
| TEバッファー、pH 8.0 | |||
| Trizma® 塩基 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 超遠心機ローター、TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| 超遠心管（7X20mm, PC） | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| 超遠心管ラック | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| 超遠心機、Optima® 最大値 | Beckman Coulter Inc. |
参考文献
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
