無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

サマリー

神経回路の制御と解析 in vivoで脳領域の所望の3次元セットにウイルスや他の試薬の配信のための技術によって促進される。我々は複雑な脳の回路の光学的操作を可能にする、カスタマイズされた流体インジェクタの配列の製作、およびウイルスによりエンコードされた光学増感剤の配信を実証する。

要約

神経回路の我々の理解 - 大幅に急速に複雑な3遺伝子を標的とするための技術によって促進される - 彼らが補助する感覚、思考、感情、そして行動、およびそれらがどのように神経や精神疾患で破損しているが、こと計算を仲介する方法 - の迅速な作成を可能次元神経回路、"回路レベルのトランスジェニックを。"我々は最近、光感受性タンパク質のウイルスのエンコーディングは、ミリ秒のタイムスケールの活性化に特定の種類の細胞を感作し、無傷の脳内で黙らせることのできる方法を開発した。ここでは、脳の3次元構造内で定義される点の数十にウイルス（または他の液体）を供給可能なインジェクタの配列の設計と実装を示す（

プロトコル

1。定位クランプの構築

1. 定位クランプは、インジェクターが定位固定アームと平行になるように、stereotaxにインジェクタのアレイを取り付けるために使用されます。
2. それは複数の手術を同時に行なうことができることが予想されていない限り、各研究室では、唯一のクランプが必要です。このケースでは、同時手術の予想最大数と同じ数を作る。また、最初の損傷の場合には、余分を加えようとするのはお勧めかもしれません。
3. 定位クランプを行うには、まず、1.5ミリメートル外径（OD）鋼カニューレは、長さ2インチにカットされ、一端は平らになるまでダウンDremeledている。
4. 次に、小片（約0.5 × 0.5 cm）をスペーサーとして使用されるように、PCBプロトタイプボードから切り出しています。
5. 行われたカットは、材料の表面に対して垂直になるようにレーザーカッターを使用して、二つの同一の長方形（1 / 2"× 3 / 8"）1 / 8"アクリルシート、の二つの円形孔を有する各四角形からカットされています長方形の対角線。最初の穴は直径1.5mmを持ち、しっかりと金属製のカニューレを保持するのに十分な大きさであり、2番目の穴は直径1 / 16"（ 図1C）を持っている。
6. 金属カニューレは、2番目の1.5mmの穴から、つの四角形の1.5 mmの穴に挿入されます。カニューレの下端は、ホッケースティックの形状を形成し、底面の長方形の底面に揃えて配置されます。
7. しっかりつの矩形間で開催されたスペーサを保ちながら、この構造体は接着の長方形にスペーサーを避けるために注意しながら、カニューレと1.5ミリメートルの穴の周りにホットグルーを使用して一緒にセメントされています。粘土は、このプロセス中に物事を一緒に保持するために役立つことがあります。
8. 接着剤が乾燥した後、1〜72ネジは長方形の上辺から16分の1穴に挿入されます。その後、1〜72六角ナットは1から72スクリューの端にねじ、と締め付けられる。ネジとナットが一緒にクランプを保持するために役立つ。
9. 底部の四角形の底面に六角ナットを添付するには、5分エポキシ少量のエポキシ樹脂は、六角ナットやネジのスレッドに取得できるようにすることなく、六角ナットのエッジの周りにドロップされます。どんな粘土が削除され、そしてそれは、スペーサーはネジを締めて、しっかりと所定の位置に保持できることが確認された。

2。ハミルトンポンプとstereotax：カスタマイズされたインジェクタの配列のためにシステムの準備

1. インジェクタアレイシステムは、脳内の座標のほぼすべてのセットにカスタマイズすることができます。
2. ユーザーが最初に設置したstereotaxで使用される適切な座標に変換する、マウス（または他の種）の脳アトラスの目的の注射部位の座標（ここで、X -、Y、およびZ座標）。注射部位の数（ 図1Aおよび1Bの3つ） 以下、K呼び出されます。
3. 10μlのハミルトンシリンジのkの数は、ハーバード大学の装置からこのような注入/撤退シリンジポンプに配置されます。
4. ポリエチレンチューブの次、3フィートの長い作品はしっかりとそれぞれのハミルトンシリンジの針に取り付けられている。
5. ポリエチレンチューブの部分ごとに、アップチャーチ科学からF - 252チューブスリーブは開放端にスライドさせると付属のナットを使用してP - 627チューブアダプターに接続し、アップチャーチ科学からも、フェルール。

3。カスタマイズされたインジェクタの配列を構築する

1. 各インジェクタの配列は、ユーザーが選択する座標のセットにカスタマイズされています。しかし、翻訳および/または回転によってのみ異なる座標のセットのために、同じインジェクタの配列を使用することができます。
2. 唯一の相対的なXおよび注射部位のY座標を考慮すると、k個の穴が"同じ相対的な間隔で、これらの穴がModelaミニ工場と0.011を使用して掘削している"厚さ1 / 32のPCBのプロトタイプボードに掘削されていますマクマスター - カーから直径のドリルビット。ドリルビットを壊したり、消耗を避けるために掘削の遅い速度（Z -スピード）を使用してください。工場からボードを取り外す前に、長方形小さいものを着用を避けるために、直径1 / 32"の大きなドリルビットを使用して、小さな穴の周りに掘られているミニミルのためのコードが簡単にMATLABを使用して生成することができます。。サンプルコー​​ドは以下のファイルで提供されています。
   1. generate.m - 目的の座標からModelaコードを生成するためのMATLABコード
   2. holes_ex.rml - プロトボードに呼び出し音のパターン（8つの穴）をあけるためのModelaコード
   3. outline_ex.rml - 穴の周り掘削四角形のModelaコード
3. 245μmのOD/100μmの内径（ID）フューズドシリカキャピラリーチューブ、ポリマイクロTechnologiesから入手は、3インチの部分のk個の数にカットされます。これらは、個々のインジェクタを備える。キャピラリーチューブの使い捨て部分は通過突かれる穴の各々は、実際のインジェクターを詰まらせることなくゴミを一掃するために。インジェクターは、それらがお互いにしっかりと平行に保持されるように、途中でそれぞれの穴に挿入されます。インジェクターは、インジェクターの配列の構造を形成し、基板にepoxiedされています。残っているのは、正しい長さにインジェクターをトリミングすることです。
4. インジェクタの配列は、アクリルの長方形の間に、して定位クランプのネジを締めて、プロトボードのいずれかの隅を配置することにより、定位固定クランプに取り付けられています。次に、クランプの金属カニューレはstereotaxの付着メカニズムを使用して、stereotaxに添付されます。
5. 以下のすべては、顕微鏡下で行われます。外側のインジェクター（つまり、他のインジェクターのいずれかに衝突することなく、ストレートエッジと側面からアプローチをすることができるもの）のいずれかの、プロトボードの底部を越えて伸びる先端をハサミでカットされます。皮質注射の場合、それはインジェクタがproto -ボードの表面を越えて約5ミリメートル延長したことは適切である。深く注射の場合、この数値は、深さの増加に対応増加させることができる。先端は、ドレメルツールを使用して平坦化される。深さの精度がそれほど重要ではない場合、インジェクタの先端にはまた、目詰まりに対して余分な予防措置としての角度で地面にすることができます。
6. 次に、安定した基準点は、定位固定アームの範囲内で選択され、インジェクタの配列は、外側のインジェクタの扁平な先端が、この基準点になるように移動されます。
7. 第二インジェクタは、対応する座標と一緒に、選択されます。第一および第二のインジェクタの座標間の高さの相対的な違いは、（z方向）であると考えられ。インジェクタの配列は、この相対距離によってZ軸方向に移動されます。第二インジェクタ第二インジェクターの先端が、現在フラットであり、基準点の高さになるよう、トリミングして、正しい長さにDremeledている。インジェクタの配列は、基準点とインジェクタの先端の比較を容易にするためにX方向とY方向に移動することができます。
8. トリミングのこのプロセスは、残りのインジェクターのために繰り返されます。

4。システム全体の組み立て

1. 定位クランプおよびカスタマイズされたインジェクタの配列は、両方とも既に構築された、この部分のために必要とされています。
2. 各インジェクタのバックエンドは（トリミングされていないエンド）、P - 235ナットとアップチャーチ科学からP - 200フェラルを使用して、F - 240チューブスリーブ青と挿入され、すでに接続されているネジアダプターに接続されているポリエチレンチューブによるハミルトンのポンプに。メーカーの指示は、詳細を相談することができます。
3. 27ゲージ針を用いて、シリコーンオイルは、システム全体がまったく空気の泡で、インジェクタの先端にハミルトンシリンジから充填されるようにハミルトンシリンジの後ろに注入されます。
4. ハミルトンシリンジがハミルトンのポンプで再配置されるように、シリコーンオイルの最大限の量は、シリンジ内に保持されます。
5. 実験は、ポンプよりも多くのシリンジが（この場合は2）のために設計されている必要がある場合は、注射器は互いにそれらを平行に保つために、そしてすべての作品があることを確認するためにプラスチック製の小さな断片（例えば、針のキャップ）を配置できますと同程度に、ポンプでプッシュ。または、マルチラックのアップグレードキットは、一度に10注射器まで保持するためにハーバード大学の装置から購入することができます。

5。注射/手術

1. 並列インジェクターで注入するプロセスは、単一のピペットで注入すると非常によく似ています。
2. 高速ポンプが大型と小型のチューブとの間の関節に負荷をかける可能性があるので、ゆっくりとリフィルを使用する/このプロセスを通じて金利を注入することが不可欠です。推奨最大速度：ウイルスをロードするための2μlの/ minとし、ウイルスを注入するために0.1μL/分。
3. 麻酔マウスはstereotaxに配置し、実験全体を通して麻酔のままです。
4. 必要に応じてマウスを準備します。例えば、メスで、シングルカットは、目の間から耳の間に、皮膚の正中線を下に行われます。皮膚は、頭蓋骨を露出するために引き戻され、そして筋膜はオフに洗浄される。プルガラスピペットはstereotaxに添付されます。耳のバーの位置ブレグマとラムダまで調整されていますが、同じ高さに揃え、そしてそれらを結ぶ線はstereotaxのY -軸に平行であるようにされています。 stereotaxの軸は、注入の座標が計算される座標系に基づいて提供いたしております。定位はブレグマのガラスピペットの先端を持つゼロ化され、その後チップはX -及び注射部位の一つのY座標でわずかに頭蓋骨の上に配置されている。
5. 骨の極めて薄い層が残るまで、歯科用ドリルを使用して、先端下に頭蓋骨は慎重に離れて比べています。ガラスピペットが低くなる可能性が掘削中の穴が正しい位置を中心とされていることを確認するためにedと引き上げた。 30ゲージ針を用いて、層の小片を優しく正しいX -とY -座標、で、オフピックアップされるので、硬膜が露出されていること。この穴は、インジェクター（0.25ミリメートルワイド）のどれにも適合するのに十分な大きさにする必要があります。 図については、 図1Dを参照してください。このように、小さい、0.25ミリメートル幅の穴がで、頭蓋骨で作られていますX -及び各注射部位に対応するY -座標。
6. ガラスピペットは、鋭利物容器に廃棄され、そしてカスタマイズされたインジェクタの配列は、定位クランプを使用してstereotaxに添付されます。
7. 正しくインジェクタの配列の角度を設定するために、二つの外側インジェクターは、以下のように、所定の基準点に校正するように選択される。インジェクタのいずれかが基準点と一致した後で、相対的なX -とこのインジェクタからの相対注射部位の間にY -の距離とその他のいずれかを考慮してください。 stereotaxの軸は、全体のインジェクタの配列は、これらの相対的な距離によってX -とY -方向に移動されるように調整されます。第二インジェクタが現在の参照ポイントに合っていない場合、金属製のカニューレを緩めて回転される。インジェクタの配列が正しく角度れるまで、このプロセスは反復的に繰り返されます。
8. 注射器は、2μlのポイント（またはそれ以上）になるまでウイルスにインジェクターを充填する前に、インジェクターは、シリコーンオイルが充填されています。これは、先端に詰まり、気泡や、簡単に、以前に記述し、注射器の後ろからシリコーンオイルで補充して、システム全体をしなくても、ハミルトンポンプを使用して前方にオイルを押すことによって削除できるように、緩衝地帯を提供します。
9. パラフィルムの滅菌ピースは頭蓋骨に配置され、インジェクターを穏やかにパラフィルムの上に低下する。大幅に変化する深さ、カスタム粉砕した部分（例えば、階段状のオブジェクト）で座標を読み込む促進することができます。
10. 以下のパーツは、ウイルスの1μLが（少量が必要な場合次の量を縮小する必要がある）各サイトでロードすることを前提としています。ウイルスの> 1μlを各サイトで注入されることを保証するためには、ウイルスの1.5μlを各インジェクタの先端にパラフィルムや階段の上にピペッティングします。
11. ハミルトンのポンプの補充率は1μL/分に設定すると、ウイルスの1.2μlを各インジェクターに補充される。
12. 最長インジェクタの先端はブレグマに0で埋められ、その後、インジェクタの配列は、そのインジェクタのX -とY -座標にシフトされます。ウイルスがすべてのインジェクタの先端から出てきた見ることができるようになるまでにも脳に注入器の先端を挿入する前に、それは、ポンプの注入を開始するために時々お勧めです：目詰まりが問題になる場合は多くの深いターゲットが関与している場合、と言う。これは、インジェクタ先端に気泡を除去し、さらには目詰まりがないことを保証します。目詰まりの場合には、ハミルトンのポンプは静かに目詰まりをクリアするために、2μlの/分の高速で短いパルスを注入するために設定されています。
13. インジェクタの配列は、正しいZ深度に、30ゲージの針で作った小さな穴から、低下する。
14. ウイルスの1μlを0.1μL/分で、それぞれのインジェクタを介して注入される。
15. 注射は、30分間放置されています。
16. インジェクタの配列が徐々に脳から抽出された後、ハミルトンのポンプは、各インジェクタの詰まりをチェックするためには、0.1μL/分の同速度で注入するために設定されています。
17. その後インジェクターを2μL/ minでエタノールを1.5μlを補充して注入することによって洗浄されます。
18. 最後に、インジェクターは各ハミルトンシリンジに2μlのバッファーゾーンを維持するためにシリコーンオイルを再充填されています。
19. すべての機器は、所属機関のバイオセーフティおよび動物使用のプロトコールにしたがって、処理の開始前および終了後に滅菌されるべきである。

6。代表的な結果

個々の時間は施術者のスキルに依存するが、並列インジェクタの配列は、セットアップと回復時間をカウントしない、インジェクターの数に等しい係数で大体手術をスピードアップします。 1マイクロリットルの注入のために、我々は通常、約直径1ミリメートル（ 図1E）の球で、レンチウイルスの発現を見た。注入の精度は、先端の位置の変動は、臨床試験から臨床試験に、約45ミクロン（先端の位置から目的の先端位置までの距離の標準偏差）となるようだ。

図1。設計、実装、およびパラレルウイルスインジェクタの配列の使用。、並列インジェクタアレイシステムの概略、3つの同時注射のために、トリプルインジェクタの構成を示す。B、に図示したようにトリプルパラレルインジェクタの配列の写真。 C、 定位クランプ、トップからアウトラインに示すようにD、効率的で、被害最小化のための手法の実例、脳内に注入器の挿入のために頭蓋骨に穴を開ける。。歯科用ドリルで、〜50ミクロンの厚さにダウン頭蓋骨薄く、その後使用してください小開頭を開くには鋭い針の先端。E、channelrhodopsin - 2を示す蛍光画像（ChR2）としてBに示すように、トリプルインジェクタの配列の標的に、3つのマウス皮質領域での細胞- GFP標識

ディスカッション

近年では、遺伝的に符号化された光学増感剤の数は、光の短いパルス（例えば^{、1,4,5,6,7,8}に対応して、時間的に正確な方法で生体内で活性化し、沈黙するニューロンを有効にしている^、11）。神経細胞が哺乳類の脳で明らかに感作されているとの主要なメソッドは、で、マウスからサルに至るまで、動物の脳にオプシンをコードする遺伝子を提供できるようなレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）などのウイルスを介してです。安全で永続的なファッション（例えば^{、2,9,10）。}ウイルスは、特に、ラットやサルなどの遺伝的モデル生物ではない生物に対して、遺伝子組換えを行うよりも高速TATを可能にし、オプシンのためにトランスジェニックのシナリオでは可能ではないかもしれない高い発現レベルを有効にすることができます。ここでは、全体の3次元の脳の構造がウイルス単一の外科のステップで、遺伝子を標的とすることを可能にする迅速なタイムスケール、"回路レベルのトランスジェニック、"で、作成することができる並列インジェクタの配列を示しています。インジェクタの配列は、各ドライブの高圧耐性のコネクタを介して、キャピラリー/フューズドシリカがポリイミド中に供給するそれぞれの注射器のセット、1つ以上の容積式ポンプで構成されています。毛細血管が割り当てられており、その後このように、ウイルスやその他の試薬は、脳領域の所望の設定に配信できるように、カスタム製粉定位位置決めボードで指定された所望の位置に、挿入。デバイスを使用するには、外科医は、まず、油を完全に流体サブシステムを埋めますウイルスに毛細血管をバックフィル、挿入する脳内のデバイス、および（<0.1μL/ min）をゆっくりと試薬を注ぎこむ。

この技術は、（などのような動作時に正確なタイミングで複雑形状の構造のミリ秒スケールのシャットダウン（例えば海馬など）、冗長的に作用してもよい二国間の構造の時間的に正確な不活化などの実験の新しい種類、多種多様を有効にします左と右扁桃体）、および複数の離散的な脳領域の摂動（例えば、の部分集合をサイレンシングしながら、クロス領域の同期が地域に各地域内の活動に依存する、または刺激的な入力方法を学ぶために位相が接続された2つの領域を駆逐ターゲット）これらの入力の効果を仲介するための重要ないくつかのターゲットのかを理解するため。霊長類のもののような大きな脳の場合は、これで我々は最近、光細胞型に特異的神経活性化^3、行動に関連した領域で活動を摂動すると、大きな、複雑な構造のウイルスのラベリングを必要とする可能性を実証している。薬物、神経修飾物質、神経伝達物質、あるいは細胞 - - 脳の複雑な3次元パターンで、時間的に正確な方法で我々は並列インジェクタの配列は、ほぼすべてのペイロードを注入するために使用されるかもしれないことに注意してください。最後に、翻訳の観点から、それは急速に、患者のカスタマイズ、遺伝子治療や薬物送達デバイスが急速になっている可能性があります特注設計の潜在的を使用して、病理学の様々な新しい治療法をサポートする、個々の脳の形状を一致させる作製光制御分子。

インジェクタの配列は、両方の空間的および容積、正確であるように設計されています。 X -とY -方向で、これは安価なミニミルを使用して非常に正確に配置された穴をあけることによって達成され、インジェクターに合わせて十分な大きさの穴と、インジェクターが互いに平行に保持されるように、そして正確に場所。 Z -方​​向で、インジェクターは定位手術そのものと同等の精度のレベルをできるように、定位固定装置を使用してトリミングされます。体積の精度は、ハミルトンのポンプの精度だけでなく、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）フィールドから適応がほぼゼロデッドボリュームコネクターから生じる。インジェクターは強いし、それがそのような鋼のカニューレなどの代替の大きな壁の厚させずに、圧力下で正確な形状と間隔を維持している十分な剛性がフューズドシリカキャピラリーチューブから作られています。小さな変更は、容易に実験の様々な並列インジェクタの配列を適合させることができます。例えば、ウイルスやより細かい間隔の小さいボリュームが必要な場合は、小さなキャピラリーチューブは、対応する小さなドリルビットと一緒に用いることができる。将来のデバイスは、サイズを（おそらく自由に動く動物の頭の上にマウントされるようなデバイスを可能にする）最小限に抑えるために、並列インジェクターの数を増やすために、マイクロ流体チャネルとポンプを利用してもよい。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ドレメルツール	ツール	ドレメル	3956-02
レーザーカッター	ツール	Universal Laser Systems	VLS2.30
ホットグルーガン	ツール	Stanley Bostitch	GR20
注入・吸引用シリンジポンプ（Hamiltonポンプ）	ツール	Harvard Apparatus	702001
10 μHamiltonシリンジ	ツール	Hamilton社	701N	注射部位ごとに1つ必要です
マウス立体定位固定装置	ツール	Stoelting Co.	51725D
Modela ミニミル	ツール	ローランド	MDX-15
0.011" ミニミル用ドリルビット径	ツール	McMaster-Carr	8915A12
1/32" ミニミル用ドリルビット径	ツール	McMaster-Carr	8848A35
高速歯科用ドリル	ツール	リンクス	333
歯科用ドリルのアクセサリー	ツール	ピアソン・アセスメント	F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
外径（OD）1.5mmのステンレス製カニューレ	材料	Small Parts, Inc.	HTX-15R
1-72 バインディング用スロット付き機械ねじ	材料	Small Parts, Inc.	MX-0172B
1-72 六角ナット	材料	Small Parts, Inc.	HNX-0172
PCBユニバーサル基板, 1/32" 厚い	材料	Digi-Key	PC57-T-ND
アクリル板、1/8インチ" 厚い	材料	McMaster-Carr	8560K239
HPLCコネクター	材料	Upchurch Scientific	F-252、P-627、P-200、P-235、F-240（これらの一部は10個パックで購入可能です。単に次を追加してください。 ‘x’ （部品番号の末尾まで）	注入部位ごとに1回につき1本必要である。ただし、F-252、P-627、およびP-235は再利用可能である。
溶融石英キャピラリチューブ、外径：245 μm, ID: 100 μm	材料	Polymicro Technologies	2000022-10M
5分速硬化汎用エポキシ樹脂	材料	Permatex	84101	5分硬化汎用エポキシ樹脂
ポリエチレンチューブ .066 x .095 インチ	材料	VWR international	63018-827