エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

サマリー

我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI / MS）を用いて酵母で数々の脂質の種を識別するための新しい定量的な脂質メタボロームの手法を説明します。このメソッドは、現在、脂質の同定と定量脂質の様々な分子形態を解決する能力で、感度、およびスピードで利用できるメソッドを超えています。

要約

脂質は、生体分子の主要なクラスの一つであり、重要な役割の膜の力学、エネルギー貯蔵、およびシグナリングを再生

プロトコル

材料および方法

1. 酵母菌株及び成長条件
   野生型株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0が ）豊富なYEPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース）で増殖させた。細胞を30℃で回転が5:1の"フラスコの体積/培地体積"比での三角フラスコで200 rpmで振盪しながら培養した。
2. 脂質の抽出のための酵母細胞の貯蔵
   
   1. 細胞の50 mlの培養液で5分間3000 × gで遠心分離によって回収した。
   2. 冷たい水で2回洗浄した。
      1. 25mlの氷冷水でペレットを再懸濁します
      2. 5分間3000 × gで遠心分離で細胞をペレット化
   3. ペレットを再懸濁し、エッペンドルフチュー​​ブに移す
   4. 遠心分離によってペレット、2分間に16,000 xgでは、使用するまで-80℃で上清と凍結を解除する。 （我々はイソプロピルアルコールのビーカーを使用するには、液体窒素を使用することもできます-80冷凍庫に保管）
3. 試薬
   バイオテクノロジーグレードのクロロホルムとメタノールは、Sigma - Aldrich社から購入した。遊離脂肪酸とトリアシルグリセロールはLarodan（マルメ、スウェーデン）から購入した。リン脂質の様々な種 - ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、およびカルジオリピンを含む - はアヴァンティ極性脂質（アラバスター、AL、米国）から入手した。テフロンライニングキャップを持つ高速ガラス遠心管はフィッシャーからのものであった。

脂質の抽出

これは、ブライとダイアー⁸で記述されたプロトコルの変更です。抽出された脂質を持つすべての操作は、ガラスピペットやシリンジを用いて実施すべきである;彼らはクロロホルムと接触する場合、プラスチックには、大きなバックグラウンド信号を作成します。正確な量は、クロロホルムのため1:2:0.8の比率限り重要ではない-メタノール-クロロホルムのためのH _2、ステップ3でOと2:2:1.8 -メタノール-ステップ7でH ₂ Oが保存されている。

1. 氷冷蒸留H ₂ Oを1.6 mlの凍結細胞を再懸濁し
2. 高速ガラス遠心管に細胞懸濁液1.6 mlを。
3. クロロホルムおよびMeOH（1:2）混合し、細胞懸濁液にガラスビーズを0.8mlの6mlを追加します。
4. 渦ガラスビーズを用いた細胞懸濁液に1分間2回。
5. クロロホルム2mlを加え、穏やかに混ぜる。
6. 時々混合しながら室温で5分間インキュベートします。
7. 蒸留H ₂ O 2 mlを加え、穏やかに混合する。
8. 時々混合しながら室温で5分間インキュベートする。
9. 室温で3000 xgで5分間遠心する。
10. 新しい高速ガラス遠心管に全体の液相を収集する。
11. 手順9からの細胞ペレットにクロロホルム3.2 mlを加え。
12. 1分間ボルテックスを2回。
13. 室温で3000 xgで5分間遠心する。
14. ステップ10から液相に上清を追加。
15. 室温で3000 xgで5分間遠心する。
16. 上段（水）相を破棄し、新しい高速ガラス遠心管に低い（有機）相を転送する。
17. 室温で3000 xgで5分間遠心する。
18. ガラスバイアルに全体の上清を移し、窒素下で乾燥させます。
19. -20℃で500のクロロホルム溶液とストア内脂質フィルムを溶かす

質量分析による脂質の分析

0.1％のクロロホルム（1:1）（v / v）の水酸化アンモニウム - クロロホルム中の脂質の基準の株式のミックスは、表1と同様にメタノールの原液ごとに事前に準備する必要があります。

1. 注入前に、表1に提供されて脂質の標準的なミックスを10μlとサンプル10μlを組み合わせる。午前1時01クロロホルムの200μLに：0.1％NH ₄ OHとメタノール。
   • サンプルの比率への標準は、必要に応じて変更することができます。
2. 1μL/分の流速でナノエレクトロスプレーソースOSを搭載したマイクロマスQ - TOF 2質量分析計を用いて脂質を解決します。
   • 正確なインストゥルメントのパラメータは、楽器から楽器ごとに異なります。ナノエレクトロスプレー源を装備したMicromass社Q - TOF 2（ウォーターズ、ミルフォード、MA、米国）のための設定については表2を参照してください。我々は質量分析計のQ - TOF型の高解像度の利点を取られているが、これは必須要件ではありません。
3. 買収後はマススペクトルは平滑化され、背景が減算され、中央にして、ピークリストをExcelにエクスポート。各脂質クラスのピークは、それらの内部標準に正規化されます。アプリケーションによっては、そのようなdeisotopingとデコンボリューションなど、さらなる後処理を行う行う必要がある場合があります。

表1内部の脂質基準、それらの濃度で標準的な混合、およびそれらの分析のためのMSモード。

脂質クラス	標準チェーンの構成	標準の質量	濃度（μg/ ​​ml）	MSモード
ホスファチジン酸	午後2時/午後二時	591.40	100	マイナス
ホスファチジルエタノールアミン	午後2時/午後二時	634.45	200	マイナス
ホスファチジルイノシトール	N /	N /	N /	マイナス
ホスファチジルセリン	午後2時/午後二時	622.37	40	マイナス
カルジオリピン	4x14：0	619.92	100	マイナス
遊離脂肪酸	午前19時00分	297.28	100	マイナス
ホスファチジルコリン	午後2時/午後二時	650.48	100	正
トリアシルグリセロール	午前13時00分/ 13：00 /午後1時00分	698.63	200	正

ナノエレクトロスプレー源を装備したMicromass社Q - TOF 2（ウォーターズ、ミルフォード、MA、米国） 表2。機器設定。

	流量率	コー​​ン電圧	キャピラリー電圧	衝突ガス
ポジティブモード	1μl/min	-28 V	3.0 KV	10
負のモード	1μl/min	30 V	-3.2 KV	10

ディスカッション

このメソッドは、容易に入手できる、安価な材料を使用して酵母のlipidomeの迅速な定量的評価が可能になります。これらの脂質は、水酸化リチウムと水酸化アンモニウムを置き換えることによって識別することができるが方法は、ジアシルグリセロール、ergosterolsとergosterylエステルを除いて、酵母細胞にある脂質の種のほとんどの同定が可能になります。説明する方法は、大きさの2〜3桁（脂質の種に応じて）を介して拡散濃度の直線性と、μg/ mlのような低い濃度で脂質の同定と定量を可能にします。ホスファチジルイノシトールのための適切な基準は市販されていないが、このリン脂質の異なる分子形態は、他のリン脂質の種のための基準を用いて評価することができる。