動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

サマリー

ヒト血小板溶解液は、増殖因子や細胞培養における強力なサプリメントの豊富な情報源となります。このプロトコルは、多血小板血漿から始まるいくつかの凍結融解サイクルを実行し、血小板の断片を枯渇させることによってヒト血小板溶解物の大規模なプールを準備するプロセスを示します。

要約

血小板由来増殖因子が効率的に細胞増殖を刺激することが示されている

プロトコル

1。出発材料

cytapheresisによって準備または軟膜から派生した多血小板血漿（PRP）の単位で始まります。

2。無菌性のチェック

不妊のために接続されている小さな袋（バクスター）にボリュームを転送することにより、各PRPのユニットから20 mLのサンプルを取るチェック。溶接することで、このバッグを外します。

3。 PRPユニットの凍結

調製直後、° Cオリジナル収納袋でさらに操作することなく、少なくとも-20 PRPユニットを下にフリーズ。

4。 HPL単位の凍結融解

細菌試験が陰性である場合、現在は37℃（水浴）氷の塊がなくなるまででHPLユニットと呼ばれるヒト血小板溶解液の単位を、解凍。 HPLを暖めるしないでください。

5。 HPLユニットのプーリング

標準化された生成物を調製一つ血小板溶解液のプールの少なくとも十から十五融解HPLの単位を取る。プーリング二重袋（MacoPharma）に連続してHPLバッグを接続し、これら2つのバッグにHPLを移す。溶接によって空のHPL袋を外します。 2つの袋の内容を混合することにより、プールされたヒト血小板溶解液（pHPL）3〜4リットルの最終容量を取得する。小さな袋（バクスター）を接続し、プールされた製品の無菌性のチェックのための20mLのpHPLのサンプルを取る。溶接することで、このバッグを外します。

6。 pHPLのPortioning

さらなる処理のために適切なアリコートを取得する部分pHPL。プーリング二重袋（Macopharma）に小さな袋（バクスター）を接続し、小規模なストレージバッグ（バクスター）を250 mLまでのボリュームを転送する。溶接によって満たされた袋を外します。

7。 pHPLのアリコートの再凍結

血小板断片化の割合、さらに凍結/解凍の手順によってリリース成長因子の量を増やします。再びポーションpHPLの小さな袋を凍結少なくとも-20℃

8。再融解しpHPLのアリコートのportioning

37 pHPL袋を解凍℃（水浴）。滅菌済みのハサミを使ってバッグのチューブを切断し、バイアルにpHPLを注いで50 mLのバイアル（ファルコンズBD）にコンテンツを転送します。細菌や真菌汚染を避けるために、層流のベンチで、この手順を実行します。

9。血小板フラグメントの除去

血小板の断片が集約する傾向があると同種免疫を誘発する可能性があるので、pHPLからそれらを削除する。 4000グラム（約15分、4℃）で従ってpHPLバイアルを遠心してください。層流ベンチピペットの最後のストレージバイアルに上清血漿（ファルコンズBD）と細胞培養でのフラグメントを避けるために、血小板ペレットを捨てる。

10。 pHPLの記憶

再び50mLのpHPLバイアルのアリコートを凍結少なくとも、20℃において実験的な使用のためにそれらを保存する。

11。細胞培養でpHPLの使用

最初にゲル形成を避けるために、培地に防腐剤フリーのヘパリンを追加します。 37℃でpHPLアリコートを解凍し、8の添加により培養液補足 - 10％。

媒体

MSC -ミディアム：

、- MEMの500mlを使用してください（詳細は1を参照することも参照）融解pHPL 56 mLを加え、防腐剤フリーのヘパリンの2 IU / mLの（ストック溶液の= 224μL）が（の凝集によって培地の凝固を避けることができます10％のpHPLの最終濃度になるように血漿中のフィブリノゲン）。また、ペニシリン（100U/mL）/ストレプトマイシン（100μg/mL）ソリューションとL -グルタミンの2mMの（両方ともSigma社）を追加します。

20μmの孔径真空フィルター（ミリポア）を介してメディアをフィルタします。 （内容、日付）を適切にボトルにラベルを付けます。

ECFC - ミディアム：

サイトカイン - アリコート、防腐剤フリーヘパリンのpHPL、10 IU / mlの（ストック溶液の=1120μl）の56 mLを、ペニシリン（100U/mL）/ストレプトマイシン（100を追加し、EBMの一瓶（500 mL）を使用してG / 20μlの細孔サイズの真空フィルター（ミリポア社）で基礎培地とフィルタへのL -グルタミンの添加）ソリューションおよび2mM。 （内容、日付）を適切にボトルにラベルを付けます。

図1：ローカルの血液銀行またはその他の認可プロバイダからの全血献血から多血小板血漿の調製。遠心分離後の血液が血漿、バフィーコートと赤血球​​に分離することができます。四バフィーコートのユニットは、血液グループOと1つ血液型AB血漿は、多血小板血漿を分離する遠心分離の前にプールできます。約300MLの定期的な品質多血小板血漿の単位はmLまたは3 × ¹¹ plateleあたり1 × 10 ⁹血小板が含まれている必要がありますtsの合計。

ディスカッション

一部の地域では多血小板血漿（PRP）はバフィー-コートは、特にテストされた献血（図1）から濃厚赤血球の生産の廃棄物であることから得ることができる。成長因子の可用性を集中する時代遅れの血小板のように最適に、PRPは、pHPLのさらなる準備のためにすぐに使用されています血小板ストレージの病変と劣化は^20〜のために少なくなります。さらに、ABH抗原とisoagglutininsの可能な影響を避けるために、血液型ABの血漿と血液グループOの血小板を照合することによって、PRPを生成することをお勧めします。これまで、細胞培養では、主にxenoimmunization ²¹と既知および未知の病原体の伝播のリスクを負うウシ胎児血清（FBS）が使用されています。そのような自己血清や無血清培地は、まだ多くのアプリケーションでFBSを置き換えることに成功していないなどの代替^。22以前の研究で我々は細胞の増殖におけるpHPLの高効率化を明らかに間葉系幹細胞の拡大に関するpHPLとFBSの影響を比較した。 pHPLを添加したEGM - 2の動物、無血清条件下での内皮前駆細胞の^7,8,2...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダブルバッグ (2 x 3.5L)	MacoPharma	VDL 8000XQ	元来は腹水穿刺用
50 mL Falconチューブ	Falcon BD	2098
50 mL ストリペット	Costar	4501
血漿バッグ (600mL)	Baxter Internationl Inc.	R4R2021
滅菌チューブ接合機	Terumo Medical Corp.	TSCD-II
シーリング装置	Fresenius Kabi	Compo Seal
恒温水槽
滅菌鋏
クランプ
遠心分離機