内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。 1,2このホワイトペーパーでは、抗ウシ予防接種のリスクを減少させるプールされたヒト血小板溶解液（pHPL）とヘパリン成人ヒト末梢血から分離し、ECFCの拡大のための新しい動物血清フリーの方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
本論文では、ヘパリンから内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）のための新規な復旧戦略を導入し、それ以外は12日間の平均値内に成人ヒト末梢血をunmanipulated。大規模な展開の後に> 1 × 10 8 ECFCsは更なる試験のために取得することができます。有利にpHPLを使用してウシ血清抗原とヒト細胞の接触を排除することができます。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学法により単離された細胞はECFCと構造がマトリゲルアッセイで試験することができるように血管を形成するためにin vitroでの機能として特徴づけることができる。さらにこれらの細胞は、皮下、in vivoで機能的、灌流血管を形成するために、マウスモデルに注入することができる。後の長期的な拡大と凍結保存、増殖、機能、ゲノムの安定性が保持されているように見える。3,4
この動物タンパク質フリーの分離と拡張メソッドはECFCsを大量に生成するために容易に適用可能です。
プロトコル
A.）ECFC ISOLATON
1日目：
- あなたが実験を始める前に細胞培養培地内皮増殖培地-2（EGM - 2）を準備する。 、ヘパリン（1000 U / mlの1ミリリットル）、ペニシリン/ストレプトマイシン（すべてSigma社、セントルイス、MO 5mlの100倍液で500ミリリットル内皮基礎培地- 2を補足www.sigmaaldrich.com 、L -グルタミン（2mMの最終濃度） ）、および50mlプールされたヒト血小板溶解液（pHPL）。 、0.2 mlのヒドロコルチゾン、2ミリリットルhFGF - B、0.5ミリリットルVEGF、0.5ミリリットルEGF、0.5ミリリットルIGF - 1と0.5ミリリットルアスコルビン酸（SingleQuotsとして提供される、すべてのロンザ、ウォーカー、MDを追加します。 http://www.lonzabioscience。 COM / ）。無菌ろ過0.2メートル、細孔径500ミリリットルミリポア真空フィルタを通して培地。 pHPLは小さな血栓を形成するので、1つの媒体のための二つのフィルタが必要な場合があります。プリウォームフィルタリングEGM - 2〜37℃の水浴で
- 6ミリリットル防腐剤フリーナトリウムヘパ....
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ディスカッション
この小説の分離と拡張メソッドは、任意のセルの分離を（不要密度勾配）回避することで、より効率的で時間がかかり、簡単で効率的なプロセスであり、従来の手法よりも安価。ウシ抗原と推定されるその後のxenoimmunizationにpHPL接触を使用することによって除外されます。培養期間中に小さな血栓がpHPLによって引き起こされる、形成することができる。我々の経験に基づいて、これらの血栓がコロニー形成し、細胞増殖や機能には影響しません。
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謝辞
著者は優秀な技術支援のためにpHPLとマルガレッタFrühwirthとダニエラターラーを提供するための博士カタリーナSchallmoserに感謝。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 内皮細胞基礎培地-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF、hFGF-B、VEGF、IGF-1、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸 | |
| 保存剤不含ヘパリン | Biochrom AG | EGM-2あたり10U/ml | |
| L-グルタミン | Sigma-Aldrich | EGM-2あたり2mM | |
| ペニシリン・ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | 100U/mL ペニシリンおよび 100μg/mL ストレプトマイシンあたり EGM-2 | |
| トリプシン/1mM EDTA | Invitrogen | T75フラスコあたり7ml CF-4用 70ml | |
| PBS | |||
| 4層セルファクトリー (CF-4) | Corning | ||
| 滅菌漏斗 | Corning | ||
| T75フラスコ2 培養フラスコ（通気性キャップ付き） | Corning | ||
| 6 mLバキュテイナーチューブ（保存剤フリーナトリウムヘパリン配合） | BD Biosciences | 108 IU/6mlをあらかじめ充填した 保存剤フリーヘパリンナトリウム | |
| 50ml Falconチューブ | Falcon BD | ||
| 5ml ストリペット | Costar | ||
| 25ml ストリペット | Costar | ||
| スクイーザー | Costar | ||
| 孔径0.2μmの滅菌フィルター | EMD Millipore | EGM-2あたり500ml×2 |
参考文献
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells vi....
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再版と許可
