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変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（dgge）

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）

こんにちは。私はハーバード大学のフェローで、微生物バイオフィルムコミュニティを研究しているセレステ・ピーターソンです。私は、16S rRNA配列と、その配列が時間的・空間的にどのように変化するかを調べることで、細菌コミュニティのプロファイリングを行っています。そのために、DGGEを用いています。これは通常のゲル電気泳動ではありません。泳動中は60°Cに維持し、バッファーを連続的にポンプで供給する必要があります。そのため、バッファーが60°Cに達するまで約1時間温めてから、泳動を開始します。次に、このプレートを希釈した洗浄液で洗浄し、不純物を取り除いてから、ライトを点灯させます。そのようなことが原因でムラが生じることがあります。すべての水分を拭き取ることが重要です。そのため、ゲルの組み立て時には、チップをゲルの外側に配置します。このように、ゲルの両側を2枚のガラス板で挟み、チップを外側に配置することで、内部のゲルに影響を与えないようにします。それでは、これらのクランプを用いてゲルを組み立て、それらを押し合わせてから、右に回して締め付けます。他のゲルと同様に、底面が密着していることを確認することが重要です。漏れを防ぐため、ここでゲルを裏返しにして、ガスケットで密閉するためにセットします。この際、プレートがガスケットと正確に揃っていることが重要です。次に、側面のノブを差し込み、下方向に押してシールを固定します。これは 30 mL シリンジです。この部品とこの部品は Bio-Rad キットに付属しており、このように取り付けます。これは、チューブ内の余分な水を取り除くためのものです。次に、ゲルに試料を注入するためにチューブをセットします。まず、チューブにアダプターを装着し、さらに針を接続します。その小型アダプターを用いて、底面のガラスのすぐ上の、ゲルのほぼ中央に針を刺します。その後、このワイヤーアダプターを長いチューブに装着し、高密度溶液と低密度溶液が入った2本のシリンジに接続します。これらはあらかじめ調製した溶液です。青いものは、これが最も変性能の高い溶液であることを示すために染料を加えています。そして、もう一方は最も変性能の低い、低密度の溶液です。これらには必要な成分がすべて含まれています。それでは、実際には週に2回分を作成します。温度を調整した後、カラムが上昇し始めるまでに、ゲルを充填するための時間は約5〜7分です。ここで、シリンジに溶液を満たします。溶液を約15 µL充填します。次に、気泡を取り除くため、上下に反転させて、上部の気泡が消えるまでゆっくりと押し出します。ここで、この小さなネジをこの溝に挿入します。このアダプターをこちらのクランプに合わせて、Cクランプで非常にしっかりと固定します。次に、このチューブをシリンジに取り付けます。反対側の高密度マトリックス側でも同様の操作を行い、注入できる状態にします。そこで、このホイールを時計回りに一定の速度で回転させます。まず、最も密度が高い青色の溶液が最初に出て、ゲルの底部を形成します。その後しばらくすると、透明な溶液がゲルを満たし始め、グラジエントが形成されます。角度を緩やかに付けます。ゲルの注入が終わったら、すぐにチューブを洗浄してください。そのままにしておくと重合してしまうためです。次に、そこにあるグループを押し下げます。この小さな部分を、そして反対側でも同様に行います。これで完了です。こんにちは。私はハーバード大学のフェローで、微生物バイオコミュニティを研究しているセレスト・ピーターソンです。私は16S rRNA配列を解析し、その配列が時間的および空間的にどのように変化するかを調べることで、細菌コミュニティのプロファイリングを行っています。そのために、DGGEを用いています。DGEとは変性ゲル電気泳動のことです。基本的には、グラジエントが存在し、DNAがそのグラジエントに沿って移動するにつれて変性するという原理に基づいています。そのため、異なる16の種は、グラジエント上の異なる位置で停止します。これにより、コミュニティ内のさまざまなセクシネス種の指紋のようなパターンが得られます。したがって、私の実験の目的は、コミュニティにどのような種が存在し、それが時間的および空間的にどのように変化しているかを確認することです。セクシネスDDDゲルを走らせ、バンドを切り出すことで、各コミュニティに存在する種を同定することができます。DDGゲルを作製する際の最大の課題の一つは、最適な勾配を決定することです。そのため、特定のコミュニティに対してどのタイプの勾配が適切か、試行錯誤して検討する必要があります。本日使用するのは35〜55% ureaの勾配です。この手法で起こりうる大きな問題の一つは、レーンにスミアが現れることです。その対策として、理由はともあれ、ゲルを非常に長い時間走らせることでスミアが消失することがわかりました。本日は一般的な細菌コミュニティに使用していますが、この方法は特定の細菌科を用いて経時的な変化を確認する場合にも利用でき、その場合は非常にクリアなゲルが得られる傾向にあります。DDGEを用いて、単一遺伝子の変異を調べることも可能です。

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）

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