マイクロ流体Perifusionデバイス内のマルチパラメトリック膵島Perifusionシステム

Summary

マイクロ流体膵島perifusionデバイスは、複数の島とカルシウム流入とミトコンドリアの潜在的な変化の同時蛍光イメージングの動的なインスリン分泌の評価のために開発されました。

Abstract

マイクロ流体膵島perifusionデバイスは、複数の島とカルシウム流入とミトコンドリアの潜在的な変化の同時蛍光イメージングの動的なインスリン分泌の評価のために開発されました。装置は3つの層から構成されています：最初の層は、島の露出表面積を流れると、最大化するために露出しながら島を固定するために役立つマイクロウェル（500μmの直径は150μmの深さ）の配列を含み、第二層は円形が含まれていますperifusion室（深さ3 mmの7mmの直径）、および第3層は入口ミキシングチャンネルが含まれており、ファンアウトの前に最適化するためのperifusionチャンバ内へ注入（幅2 mm、長さ19ミリ、高さは500μm）混合効率は、前perifusion室に入る。リニア、ベルの形状を含む様々なグルコースの勾配、および正方形の形状の作成もマイクロ流体perifusionのネットワーク内に作成することができると示されている。

Protocol

3層構造マイクロ流体perifusionデバイスのA.の微細加工

底もマスタープロトコル（150μmの深井戸）

1. 必要に応じて、カミソリの刃を用いてウェハをクリーニングします。アセトン、メタノール、及びIPAで清掃してください。 30秒、50ワットでのプラズマ処理を実行
2. スピンSU8 - 100 @ 2000 rpmで。 [ステップ1：500回転、10秒、100回転/秒、ステップ2：2000回転、30秒、300rpmで/秒]。
   [注：SU8を回転した後、ピンセットでウエハを保持していない]
3. ソフトベークで65ウェーハ℃で20分間、95℃で50分間C。
4. ウェハは、所望のマスクを通してUV光にさらされています。 150μmの高さのための投与量は650ミリジュール/ cm ²である。
5. 露光後は65でウエハを焼く℃で1分間及び95℃Cで12分間。
6. 15分間SU8開発者のウェーハを開発する。

マイクロチャネルマスターのプロトコル（500μmの深井戸）

1. 必要に応じて、カミソリの刃を用いてウェハをクリーニングします。アセトン、メタノール、及びIPAで清掃してください。 30秒、50ワットでのプラズマ処理を実行
2. スピンSU8 - 2150 @ 1000 rpmで。 [ステップ1：500回転、10秒、100回転/秒、ステップ2：1000回転、30秒、300rpmで/秒]。
3. ソフトベーク65℃ウェハ° Cで1​​5分間、95℃で2時間と30分間。
4. ウェハは、所望のマスクを通してUV光にさらされています。 650μmの高さのための露光量は685 MJ / cm ²である。
5. 露光後は65でウエハを焼く℃で5分間と95℃〜35分間。
6. 20〜30分のためのSU8開発者のウェーハを開発する。

PDMSの溶液の調製

1. ポリジメチルシロキサン（PDMS）ソリューションは、完全に標準Sylgard 184キットの硬化剤1部とシリコーンエラストマーの10部を混合することによって調製される。
2. 混合プロセス中にPDMSの溶液中で生成された気泡は、真空デシケーターを使用して削除されます。
3. 泡のないPDMSの溶液を徐々にSU8マスターと第三層のための空のペトリ皿上に分配される。
4. ホットプレートの温度を75に設定されています° CとPDMSは2時間、この温度で​​硬化させる
5. インレット、アウトレットと交換ウェルを適当な大きさの穴パンチャーを使用して打ち抜かれている。
6. 層は、ハンドヘルドプラズマ装置を用いてスライドガラス（サイズ0.1 mm）に一緒に結合されています。

B.実験セットアップ

1. マイクロデバイスを介してフローを70％エタノールで滅菌する。フローDIは、水、エタノールを洗い流すこと。マイクロチャネルの壁にインスリンの非特定の吸着を防止するためにデバイスを介して0.5％BSAを50mlを灌流。
2. グルコースのランプの勾配とシリンジポンプは勾配が安定していることを確認するためにテストされていると通信するLabVIEWソフトウェアで生成された他の関連グラデーション。
3. 25から30マウスの膵島は37℃で30分間、5μMのFura-2/AM（カルシウムインジケーター、分子プローブ、CA）および2.5μMのローダミン123（Rh123、ミトコンドリア電位のインジケータ、シグマ、MO）とともにインキュベートした2mMのグルコースを含むクレブス - リンガー緩衝液（KRB）
4. マウスの膵島は、慎重に入口ポートを通じて流体perifusionデバイスにピペッティングしている。
5. マイクロ流体ネットワークは、タイゴンチューブとYコネクタやフラクションコレクターへのコンセントを使用してシリンジポンプへの入口を接続することにより、セットアップです。デバイスは、顕微鏡で加熱ステージ（37℃）上にあり、入口配管は、37室と溶液の温度を保つためにホットプレート上で加熱℃に
6. すぐにセットアップした後、マウスの膵島は、KRBは、その後、10分および25分のためのグルコースのランプ（2mMの25ミリメートル）に2 mMのグルコースを含むでperifusedされています。
7. タイムラプス画像はSimplePCIソフトウェアによってすべての15秒を収集し、分析されています。 perifusateはまたELISAキットを用いてインスリン分泌を分析するためにフラクションコレクターを使用して分単位で収集される。

代表的な結果

マウスの膵島は、2月25日mMグルコースの直線勾配でperifusedていた。図1に示すように、カルシウムの流入とインスリン分泌は、6 mMのグルコースに相当するperifusionの約13分、後にトリガされます。ミトコンドリア電位の変化は、約11分で、以前予想されると見られている。このデータは、膵島の生理学を特徴づけるためにこのマイクロ流体ネットワークを使用する利点を示しています。

図1。細胞の刺激を小島に生理反応。

Discussion

伝統的な膵島perifusionシステムは、（マクロスケールとマイクロスケール）設定とデザイン、高い技術要件、およびシステム内のユーザ所定の化学的勾配を作成するには難しさの複雑なを含むいくつかの制限があります。ここで説明するマイクロ流体perifusionシステムは、設計と製造のシンプルな形状で、これらの制限を克服しています。さらに重要なことは、このシステムは、膵島生理学を研究するユニークなツールとして提供する蛍光イメージングのアプローチに統合することができます。高い信号対雑音比とこれらの蛍光シグナルの時空間分解能で実証システム。現在のプロトタイプのデバイスはまた、ワンチップで複数のperifusionセットアップを開催し、広範なアプリケーションの目的のために微小環境の様々なタイプを提供することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
60mlシリンジ	BD Biosciences
Fura-2 蛍光色素	Molecular Probes, Life Technologies
Rhodamine123 蛍光色素	Molecular Probes, Life Technologies
Glucose	Sigma-Aldrich
ウシ 血清 Albumin	Sigma-Aldrich
30インチシリコーンチューブ	コールパーマー		1/16 x 1/8インチ
1.5ml エッペンドルフチューブ	フィッシャーサイエンティフィック
Yコネクター	コールパーマー		1/16” & 4mm
シリンジコネクター	コールパーマー		メス ルアープラグ 1/16”
ストレートコネクタ	コールパーマー1		/16”
エルボーコネクタ	コールパーマー1		/16”
ハーバード シリンジポンプ	ハーバード 装置
ペリフュージョン装置
ホットプレート	PMC
温度計	オメガエンジニアリング
フラクションコレクター	Gibson
Pippettor	Fisher Scientific
倒立エピ蛍光顕微鏡	オリンパス株式会社	IX71
電荷結合装置	QImaging		Retiga-SRV, Fast 1394