組織学、組織形態計測および蛍光色素分析のためのUndecalcified骨の準備

サマリー

Undecalcified骨の組織学、臨床と研究のさまざまなアプリケーションのための重要な情報を提供します。それは、特に大きなサイズの標本で、技術的に困難です。このビデオでは、良質のセクションを生成するプロセスを示していますし、それらを克服することで技術的な問題とメソッドを示しています。

要約

Undecalcified骨組織は、骨のマイクロアーキテクチャを示しています。それは、骨代謝や骨形成と骨吸収に関する重要な情報を提供する骨の鉱化と細胞成分の両方を示しています。これは、臨床と研究のさまざまなアプリケーションにおいて非常に大きな重要性を持っています。それは、美しい画像^1を得られますし、そのような蛍光色素の評価や組織形態計測²のようなテクニックが可能になります。蛍光色素の分析ではカルシウムに結合する蛍光色素がその時点で鉱化量の定量化を可能にする特定の時点、で注入されている技術です。組織形態計測は、顕微鏡レベルで骨の定量化のプロセスです。

undecalcified骨の組織学を実行すると、特に大きなサイズの標本で、技術的に困難です。それは組織学を埋め込まれた標準的なパラフィンで使用されているものから技術の変化を必要とします。このビデオでは、良質のセクションを生成するプロセスを示していますし、それらを克服することで技術的な問題とメソッドを示しています。試料の準備、固定と処理が他の軟部組織と同様の方法で達成されている、しかし密度に起因すると骨の低透過性がかなり長く固定して、処理時間が必要とされる、多くの場合、数週間服用。埋め込みは、メタクリレート系樹脂などの骨に似てたり、同じ硬さと密度との支持体を使用して達成が、パラフィン浸透および埋め込みとは異なり、これは不可逆的な段階です。切片は、蛍光分析などの研究に最適な厚いセクションを、産生する研削することによって達成することができます。これは、最善のmacrotomeにダイヤモンドブレードを使用して実現されます。また、薄い切片を光学顕微鏡のために製造することができ、これは非常に鋭い刃でそりのミクロトームを使用して実現されます。そりミクロトームは、大規模な、ハードブロックに必要な追加の強度と安定性を提供します。樹脂埋込みのセクションは、実証されている汚れの様々な、で染色することができます。

プロトコル

1. 組織は、10％のリン酸塩を含む密閉容器にホルマリン溶液^3をバッファに配置されます。蛍光分析は蛍光色素が光に敏感であるため、実行する場合は、光に最小限の露出を確認してください。
2. 組織の方向が要求される確立。
3. サイズの試料をトリミング、正しい向きで、バンドを使用して見た。安全対策が守られることを確認します。試料はその後不透明な容器に入れている、の量は十分な固定を実現するために試料の約10倍のサイズにする必要があります。試料は、ホルマリン溶液で、そのサイズに応じて1から2週間の合計ままにしてください。それは、テストと最適化のために制御の組織を用いて提案されている。
4. 組織は、埋め込み型にフィットし、70％エタノールを含む密閉不透明な容器にティッシュを置く確認してください。
5. 軽いからと一定の撹拌下シールド、エタノールの濃度を昇順で組織を処理する。
   1. 70％エタノール1週間
   2. 80％エタノール1週間
   3. 90％エタノール1週間
   4. 100％エタノール1週間
6. 組織はその後、再び光から、一定の撹拌下シールド、1週間ブタノールにクリアされます。
7. 樹脂と骨の密度を厳密に一致する必要がある。樹脂の密度が変更（ステップ8を参照）、我々は適切な密度を確保する最初の試験片を埋め込 ​​むことをお勧めすることができます。我々は、光学顕微鏡と蛍光色素分析のためにTechnovit 7100（ヘレウスKulzer）を使用してください。免疫組織化学が必要な場合は代替の樹脂は、そのようなTechnovit 9100（ヘレウスKulzer）として使用する必要があります。
8. Technovit 7100調製液は、必要に応じて、キットに付属の軟化ソリューションの小アリコートと混合してもよいが、せいぜい5％に調製液の量は、我々の経験で軟化ソリューションはほとんど必要ありません。無水エタノールとベースの液体Technovit 7100等しい部分は光の露出を最小限に抑え、24時間のプレ浸透液とし、撹拌しながら混合し、組織に適用されます。
9. 浸透溶液を100mlのベース液に溶解さ1gの硬化剤I（= 1袋）を使用して構成されています。これは、事前に浸透液を置換し、一定の撹拌下に1週間のために潜入するために許可されています。
10. 切削面を下向きにして、金型に組織を置きます。樹脂のための組織の周囲の余白が（理想的には最低5ミリ）があることを確認、これは、ブロックの強度を確保。硬化剤II 1mlでTechnovit 7100調製液の15mlsを混合し、金型の試料の周りに注ぐと、少なくとも5 millimietresでそれをカバー。硬化時間は2時間以内に開始されますが、一晩完全になります。
11. 取付けは、次にTechnovit 3040（ヘレウスKulzer）を使用してバッキングブロックをfashioningによって実行されます。粉1部の液体の粘稠な液体を得るために2部の体積比でTechnovit 3040を混在させる。ブロックのベース上に2 mm以上のレベルまでブロックの背面にあるくぼみにTechnovit 3040を注ぐ。約10分後に金型を剥がし、ブロックの準備が完了することができます。
12. 密度、したがって、メタクリル樹脂の切削特性は、部屋の周囲の湿度の影響を受けやすくなっています。ブロックは、したがって、デシケーター中に保管してください。
13. 地上のセクショニングは厚さ20から50マイクロメートルの間に大きなセクションを生成します。厚いセクションでは、明るい蛍光を生成するとして、それは（下のセクションを参照）蛍光色素の分析に便利です。 macrotomeにダイヤモンドの刃を固定します。 macrotome上の貯水池に、石油スピリットなどの潤滑剤を、追加。クランプでブロックを固定し、ブレードに親しませる。十分な潤滑を確保する（セクションあたり約20-30分）をゆっくりと発生する研削が可能です。最初のセクションでは、切断面を公開し、セクションが、それは破棄されなければorientates。
14. 次のセクションは、Superfrostプラススラ​​イド上に配置されます。セクションでは、我々はその上にサンドイッチ用の袋の部分を配置し、別のスライド位置にクランプを持つそれは平らな保有を推奨するようカールする傾向を持っています。その後、1時間摂氏60から80度の間のインキュベータに入れられます。これは、メタクリル酸を柔らかくし、セクションが平坦な方法で、スライドに付着することができます。
15. 穏やかな方法で、細かいグリットのサンドペーパーを使用して、必要に応じて地上部を洗浄し、研磨されることがあります。
16. そりのミクロトームは、光microsocopyに最適なセクションを提供する薄いセクションを、カットします。それはこれらのハードIPブロックを切断するために必要な剛性を、追加したとして、そりのミクロトームを使用してください。またパワーロータリーミクロトームを使用することができます。シャープなステンレススチールの刃を使用してください。これは、1つが使用されている他のようにシャープにすることができるように利用可能な2つのブレードを有することが好ましい。刃は、ブロックで45度の角度を確認する必要があります。蘇rfaceの軟化は、必要に応じてブロックするために湿紙を適用することによって達成することができます。それは質のセクションを取得するために必要な切削条件を達成するためにいくつかのセクションがかかる場合があります。セクションは、水浴に上場し、上記16のようにスライド上に配置されます。
17. 染色試薬は、以下の資料に記載されています。プロトコルは、バンクロフト⁴らに基づいています。厚さのばらつきに起因するそれは、テストスライドの汚れを最適化することをお勧めします。ラックの染色は、組織が必要とされるフラットスライドに直接汚れを追加するようにスライドをオフフロートする可能性があります。同一のプロトコルまたはラックの染色は、組織形態計測に必要な一貫性のある染色成果のために必要です。
    1. ヘマトキシリン​​とエオシン
       1. Haematoxyilin 5〜10分で染色
       2. スコットの水道水でよく洗う
       3. エオシン5分で染色
       4. 水道水で洗う
       5. キシレンでクリア
       6. マウント
       7. 結果
          1. 類骨=ピンク
          2. 石灰化骨=紫褐色
          3. 核=青
    2. フォンコッサ
       1. 硝酸銀溶液の場所と石灰化骨が黒くなるまで、強い光にさらす（約10分）
       2. 蒸留水で3回洗浄
       3. 5分間チオ硫酸ナトリウムと脅威
       4. 蒸留水で洗う
       5. Safrinin Oとの対比
       6. キシレンでクリア
       7. マウント
       8. 結果
          1. Mineralised骨=黒
          2. 類骨=赤/ピンク
    3. マッソンゴールドナーのトリクローム
       1. アルカリ性アルコールで洗浄する（80％エタノールおよび20分間25％アンモニアの10mlsの90mls）
       2. 水ですすいでください
       3. 蒸留水ですすぎ
       4. 10分間ワイゲルトのヘマトキシリン​​で染色
       5. 蒸留水ですすぎ
       6. ポンソー-フクシン最終的な解決策で5分間染色
       7. 1％酢酸で15秒リンス
       8. リンモリブデン酸、オレンジG液5分で染色
       9. 1％酢酸で15秒リンス
       10. 薄緑の5分で染色
       11. 1％酢酸で3変更をすすぐ
       12. 蒸留水ですすぎ
       13. マウント
       14. 結果
           1. Mineralised骨=緑
           2. 類骨=赤/オレンジ
           3. 核=ブルーグレー
           4. 軟骨=紫
18. 蛍光色素の調製：
19. これらは、少なくとも二週間離れて、ゆっくりと静脈内注射により投与されています。
20. 用量
    1. カルセイングリーン10 mg / kgのIV
    2. オキシテトラサイクリン50 mg / kgのIV
    3. アリザリンコンプレクソン30 mg / kgのIV
21. カルセイングリーンの調製
    1. 溶けるまでカルセイングリーン1gを1 M NaOHで滴定する。
    2. pHは= 7.1から7.2まで、1％NaOHで調整されます。
    3. フィルタリングと光から遮蔽してください
22. アリザリンコンプレクソンの準備
    1. 溶けるまでアリザリンコンプレクソンの3グラムを1 M NaOHで滴定する。
    2. pHをpHが7.1から7.2 =まで1％のHClまたはNaOHで調整されます。
    3. フィルタリングと光から遮蔽してください
23. オキシテトラサイクリンの準備
    1. オキシテトラサイクリンは、既製の抗菌薬として使用可能です。調製は不要です。

材料

A）Hemotoxylinソリューション
Hemotoxylin	1グラム
無水アルコール	100mLの
B）鉄溶液
30％水性塩化第二鉄	4mlの
塩酸（濃縮）	1mLの
蒸留水	95mL

A）ポンソーデキシリジンソリューション
ポンソーデキシリジン	0.75グラム
酸fuchsion	0.25グラム
酢酸	1mLの
ミックス、および追加蒸留水（100ml）
B）azophloxinソリューション
Azophloxin	0.5グラム
酢酸	0.6mL
ミックス、および追加蒸留水（100ml）
C）決勝は、染色液を進め
ポンソー-フクシン液	5 - 10mLを
Azophloxin	2mLの
0.2パーセント酢酸溶液	88mL

ライトグリーン	1グラム
酢酸	1mLの
ミックス、および蒸留水を（500ミリリットル）に追加

リンモリブデン酸	3グラム
オレンジG	2グラム
蒸留水の500ミリリットルに溶解し、結晶チモールを追加。

1％水溶液硝酸銀

2.5％チオ硫酸ナトリウム

1パーセントサフラニンO

アルシアンブルー8GX	1グラム
3％酢酸溶液を	100mLの

a）のハリスのhemotoxylin
Hemotoxylin	2.5グラム
絶対アルコール	25mL
カリウムミョウバン	50グラム
蒸留水	500mLに
酸化水銀	1.25グラムOR
ナトリウムヨウ素酸	0.5グラム
氷酢酸	20mlの
B）エオシン液
市販のエオシンを使用した。

メーカー	蛍光色素	カタログ番号
Sigma - Aldrich社、シドニー	カルセイングリーン	C0875
Sigma - Aldrich社、シドニー	アリザリンコンプレクソン	A3882
インターオーストラリア、ビクトリア	オキシテトラサイクリン （棚抗菌薬オフ）	商品名; Engemycin 100