このビデオでは、ハワイの不名誉除隊イカから血球（血液細胞）を取得する方法を紹介します Euprymna scolopes細胞生物学と細菌付着アッセイで使用するため。血球は、蛍光色素で染色し、GFPで標識した細菌にさらされる。
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この記事について
サマリー
要約
有益なバクテリアとホストの間の分子のシグナル伝達を媒介する免疫系の役割に関する研究は、近年では、それらの細菌と真核生物の共進化の理解に多大な貢献をいただきました。ハワイのボブテイルのイカとの間の共生の関連付け、
プロトコル
- 0.22μmの濾過滅菌人工海水500 MLS（;塩分35 pptのFSW）を準備する。 0.22μmのミクロンフィルターを介してフィルタ人工または天然の海水は、粒子や細菌を除去する。
- FSWにおけるエタノールの2％溶液に配置することにより、大人一人ハワイの短い尾イカ（Euprymna scolopes）を麻酔。約10分間麻酔で動物を置きます。イカは水泳を中止し、積極的に触れるには応答しません。継続的な呼吸、マントルの動きによって示される、と色素胞の活動はまだ観察する必要があります。
- 標準的なワックスの解剖トレイに上に向けて腹側でイカを置きます。 FSWは、2％エタノールを含むと動物水没。
- つの標準200μlのピペットチップを使用して、漏斗と両目の間にある主な頭部血管を露出するマントルを引き戻す。
- 26.5ゲージの針、穿刺頭部血管と血リンパの50〜100μlの間に撤退した滅菌1 mLシリンジを使用する。氷上に滅菌済み1.5 mLチューブに血リンパを置きます。
注：動物は、ドナーが複数回となる場合、唯一の任意の時点で血リンパの10-20μlを撤回。通常の海水タンクに動物を返します。動物は30分以内に復活されます。 - 採取直後の血球を洗浄し、イカリンガーのソリューション（S -リンガー、530 mMのNaCl、10mMの塩化カリウム、25 mMのMgCl 2、10mMのCaCl 2及び10mMのHEPES緩衝液、pH7.5）500μlに再懸濁している。
- 血球濃度を血球計数器によって決定され、約2,000細胞はチャンバーのガラスのカバースリップに添加し、室温で10分間ガラスに付着させています。この密度では、血球には、ガラススライドの表面上に均一な単層を形成する。
- ホストの血球への細菌の結合を観察するには、血球は、 ビブリオfischeri ES114および/ またはビブリオharveyi B392、緑色の蛍光レポーターを含むそれぞれのように蛍光標識した細菌株にさらされている。V. fischeri ES114とV. harveyi B392は28の海水トリプトンメディア（SWT）における中期対数増殖期°旋回式シェーカーでCに栽培されています。 600nmの光学密度は、細胞密度を決定するために分光光度計によって測定されます。細菌は、遠心分離（5分間5,000 rpmで）によりペレット化している、上清を捨て、そしてペレットをS -リンガーに再懸濁されている。
- 10万細菌細胞はよくその平均で血球当たり50の細菌が存在することを各チャンバーに追加されます。血球/細菌混合物を25 S -リンガーのソリューション℃で1時間、バインディングの最大レベルを得るために決められた時間のためのCでインキュベートする。
- 血球の細胞質は、蛍光0.005パーセントCellTrackerオレンジ（Invitrogen）で染色後、細胞を可視化するS -リンガーで洗浄されています。
- 関連付けられている細菌染色血球のいずれかツァイスディスカバリーV20蛍光ステレオスコープまたはライカSP2スペクトルレーザー共焦点顕微鏡を用いて蛍光して表示、および動物細胞の表面全体に列挙されます。
代表的な結果
頭足類血リンパは細胞外ヘモシアニンではなくヘモグロビンが含まれているため、酸素化により、血リンパには濃い青に変わります。血リンパのウェルあたり〜5000血球の平均は、このメソッドを使用して取得されます。チャンバーカバーガラスと蛍光染色に固執した後、血球は形の明るく蛍光赤とアメーバ状に表示されます。細菌付着、V.用fischeriしばらくV.（血液細胞あたり1-2細菌細胞）血球に不完全に従うことになりますharveyiは （血球10-15細菌細胞）に強く付着する。
図1。成人ハワイの不名誉除隊イカEuprymnaは頭部の血管の位置を示すscolopes。
図2。 ビブリオfischeri（）とビブリオharveyi（B）への血球の暴露の結果。赤、セルトラッカーオレンジ、グリーン、GFP標識細菌。
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ディスカッション
有益なバクテリアとホストの間の分子のシグナル伝達を媒介する免疫系の役割に関する研究は、近年では、それらの細菌と真核生物の共進化の理解に多大な貢献をいただきました。イカ/ビブリオシステムはこのフィールド2,3,5,6,8での基本的な質問に答えるために扱いやすいモデル系としての地位を証明しています。イカEuprymna scolopesの光器官は発光細菌ビブリオfischeriによって排他的に植民地化を可能にします。組織その家は、バクテリアが海水と接触して残るので、イカは、特定の共生を促進だけでなく、他の細菌を排除するために継続してはなりません。継続的な研究は、マクロファージのような血球はおそらくこの協会1,4,7の確立と維持において重要な役割を果たすことが明らかになっている。イカのホストは適応免疫がないため、この関連で発見驚くべき特異性は、全体または部分的に自然免疫系を介したものである必要があります。これらの血液細胞の最近の調査では、Eから血球が分離されたことを明らかにscolopesは認識し、貪食V. fische...
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謝辞
資金源：SVNへコネチカット研究財団と分子細胞生物学専攻の大学、シグマ西費補助金 - の研究とアントニオH.とMajorie R.
AJCにロマノ大学院教育フェローシップ
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Lab-Tekチャンバー付き#1.0ホウケイ酸カバーガラスシステム（8チャンバー） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| 26.5 G 1ml ラテックスフリーインスリン用注射器 | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| SteREO Discovery V20 顕微鏡 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| SP2 共焦点顕微鏡 | Leica Microsystems |
参考文献
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
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再版と許可
