方法論記事

マウスの横大動脈狭窄

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DOI：

10.3791/1729

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2010年4月21日

 ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine (BCM), 2The Margaret M. and Albert B. Alkek Department of Medicine, Baylor College of Medicine (BCM)

この記事について

サマリー

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、心肥大や心不全の開発の基礎となるメカニズムを研究するために一般的に使用される実験的なモデルです。ここで、我々は、マウスの心肥大の再現性の学位を作成するために大動脈を収縮する手順を説明します。

要約

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、圧負荷誘発性心肥大および心不全のための一般的に使用される実験的なモデルです。

プロトコル

パート1：術野の準備

  1. 動作フィールドは、75％イソプロピルアルコールで消毒されています。
  2. 加熱パッドは上と右の温度でであることを確認してください。推奨されるシステムは、37℃で維持されている治療のパッドに接続されている水の循環ポンプGaymar℃± 1℃です。心拍数の急激な低下を避けるために手術中に正常な体温を維持することが重要です。
  3. 手術器具は、手術前にホットビーズ滅菌器で滅菌されています。鈍はさみ、もちろん曲がったピンセットX 2、罰金45 °傾斜鉗子X 2、角度の春のはさみ、胸リトラクタ、およびニードルホルダー：この手順では、以下の手術器具が必要になります。
  4. コットンアプリケーターは、出血の場合には手にしてください。

パート2：マウスの​​調製と挿管

  1. マウスは0.5 -1.0 L /分100％O 2と混合イソフルラン2％の誘導室内で麻酔する。
  2. バリカンは、ネックラインからミッド胸の高さに毛を剃るために使用されます。
  3. マウスは、体温を維持するために加熱パッドの上仰臥位に配置されます。
  4. ゴムバンドを首を拡張するために動物の前歯の上に置かれる。片手で湾曲した鉗子を使用して、舌を優しく側に操作されます。一方で、気管内挿管はPE 90チューブを使用して実行されます。気管内チューブは、125〜150回/分および0.1〜0.3ミリリットルの一回換気量で、ハーバードのボリュームを再投入齧歯類の人工呼吸器のサイクリングに接続されています。 1.0 L /分100％O 2 -手術中、麻酔は0.5とイソフルラン1.5から2パーセントに維持されている。麻酔の適切なレベルは、マウスの爪床（つま先ピンチ反射）に圧力を適用することによって検証されます。
  5. 手術野を70％アルコール、続いbetadine液で消毒されています。この手順を3回繰り返されます。
  6. 運転中に手術野の汚染を防ぐために、滅菌ドレープは、操作フィールドが公開されたまま、マウスの上に配置されています。
  7. 滅菌手袋のセットは、個々のマウスに使用されます。

パート3：横大動脈のライゲーション

  1. 第二肋骨までの部分的開胸術は、手術用顕微鏡下で行われ、胸骨は胸のリトラクターを使用して、収納されています。
  2. ファイン先端45 °傾斜鉗子を穏やかに大動脈弓から胸腺と脂肪組織を分離するために使用されています。
  3. 横大動脈の識別に続いて、6.0絹縫合糸の小片は、腕頭と左総頸動脈（図1）の間に配置されます。
  4. 二つの緩い結び目が横大動脈と27の小片の周囲に関連付けられています½ゲージ鈍針が横大動脈に平行に配置されます。第一結び目はすぐに、針で引き分けた第二に続くと針は速やかに直径0.4mmの収縮を得るために削除されます。偽対照マウスでは、全体の手順は、大動脈のライゲーションを除いて同一です。
  5. 胸のリトラクタが取り外され、再度膨らませる肺に2秒間人工呼吸器ピンチオフの流出された。
  6. 胸郭は、結節縫合パターンを6.0 proleneの縫合糸を使用して閉じられます。
  7. 皮膚は連続縫合パターンを6.0 proleneの縫合糸を使用して閉じられます。

パート4：手術後の回復

  1. 術後鎮痛のために、マウスは、ブプレノルフィン（0.1 mg / kg）を腹腔内に注入されます。手術後の脱水の兆候がある場合は、滅菌生理食塩水を腹腔内に与えられます。
  2. 麻酔が徐々にオフの位置に下げ、自発呼吸の兆候が発生したときに気管内チューブは削除されます。
  3. マウスは、発生しやすい位置に移動し、加熱パッドを回復するために許可されています。

第5部：横大動脈の成功ライゲーションの確認

  1. TAC 1週間後、マウスは横大動脈の結紮により誘発される圧負荷の程度を決定するために再麻酔です。上述したように、麻酔は0.5とイソフルラン1.5から2パーセントに維持されている- 37℃に維持1.0 L /分100％O 2と体温℃± 1℃の
  2. 20 MHzのドップラープローブは、流速を検出するために45 °の角度で首の左右両側に配置されます。コンピュータベースのドップラー信号プロセッサ（インダスインスツルメンツ、ヒューストン、テキサス州）は、ドップラー信号を表示および格納するために使用されました5。
  3. 実験的なプロトコルに必要な圧負荷の程度に応じて、一定の範囲内で右頸動脈（RC）/左頸動脈（LC）流量比を持つ唯一のマウスはさらなる分析のために含まれています。深刻な圧負荷を伴う厳密なくびれがtを導くのに対し、例えば、圧負荷中程度は、5-8の比率につながる8-10 OAの比（図5.3A）。シャム動物は（運営が連結していない）、しかし、〜1（図5.3B）の比率が期待される。

6：代表的な結果

野生型マウスでTACを以下の典型的な手術の生存率は約80〜90％です。横大動脈の手術が成功結紮は5-​​10の右と左総頸動脈との間のドップラー流速比（RC / LC）（図1）につながる。偽手術したマウス（図2A）と比較すると、圧負荷を持つマウスは、くびれの気密性（図2B）に応じて、6〜8週後1-2週間以内に心臓肥大、および心拡張を開発することが期待されています。遺伝子組み換えマウスは別の生存率を示すかもしれないがTACの後の最初の月の間に死亡率は、野生型マウスに（<20％）一般的に低いです。6,7

図1
図1。ドップラー速度計測を用いて横大動脈ライゲーションの確認。右の代表ドップラー速度信号（RC）と左頸動脈（LC）動脈6日後のTAC。これらの録音は、〜6.8のRC / LC流量比で成功したライゲーションを示しています。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2
図2。 TACに続いて代表的な心臓全体の画像。 。擬似手術野生型マウスの心臓。B。野生型マウスの心臓16週後のTAC。各ライン= 1ミリメートル。

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ディスカッション

人間の大動脈弁狭窄症を模倣TACは、マウスでは心肥大や心不全を誘発することが一般的な方法です。大動脈狭窄のための代替サイトは、昇順および腹部大動脈が含まれています。大動脈狭窄を昇順とは、左心室（LV）上に極端な、より迅速な過負荷を提供します。対照的に、腹部大動脈狭窄は、可能な補償の手段として、循環の無傷の大部分を残します。従って8には、調査へのより従順時間依存の方法で十分なLVの過負荷を提供するとして、TACは、しばしば好ましいモデルです。この手順は練習で、技術的に困難なことができますが、我々は、野生型マウスで80〜90％の生存率を達成しています。

横大動脈狭窄の気密性は、肥大の開発の度合いと心不全と拡張が発達する時間枠を決定する。また、マウスの年齢は、心不全の開発の回収率と反応速度に影響を与えます。それ以上の年齢のマウス（年齢の> 12ヶ月）は、TACに頸動脈の適応応答を開発するために時間がかかり、そしてより速くより若いマウス（生後3〜4ヵ月）より拡張型心筋症を発症する可能性があります。5

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謝辞

XHTWは、医学研究でWMケック財団特別若い学者であり、そしてまた、NIH / NHLBIの助成金R01 - HL089598とR01 - R01HL091947、および筋ジストロフィー協会の助成金＃69238でサポートされています。 RJvOは生理ゲノミクスにおける2008年から2010年、アメリカ生理学会ポストドクトラルフェローシップの受賞者です。この作品は、CaMKIIはハートでシグナリングのための財団Leducqアライアンスによって部分的にサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Gaymar T/pumpHarvard ApparatusModel TP-500循環水ポンプ
温度治療パッドHarvard Apparatus60-3414
ホットビーズ滅菌器Fine Science Tools18000-45
鈍端剪刀Roboz Surgical Instruments Co.RS-5980
角度付きスプリング剪刀Roboz Surgical Instruments Co.RS-5668
胸部開創器Fine Science Tools17002-02
粗い曲線ピンセットRoboz Surgical Instruments Co.RS-5138
Dumont 精密 45° 角度付きピンセットFine Science Tools11253-25
持針器Fine Science Tools12565-14
電気シェーバーGE Healthcareマウスの被毛切除用
PE 90 チュービングBD Biosciences427420挿管用
MiniVent（人工呼吸器）Harvard ApparatusType 845
ベタジンFisher Scientific19-027132医療用品店で購入可能
滅菌手袋Mckesson20-1565
実体顕微鏡UnicoZM186
6-0 シルク縫合糸Fine Science Tools18020-60
27 ½ ゲージ針BD Biosciences305109
6-0 プロレン縫合糸Mckesson3286
ブプレノルフィンInstitutional Animal Facility

参考文献

  1. Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
  2. Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
  3. Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
  4. Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
  5. Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
  6. Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
  7. Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
  8. Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).

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