このビデオでは、血管新生の反復するいくつかの段階そのin vitroでの血管新生アッセイのプロトコルを示しています。タイムラプス発芽の画像、管腔形成、分岐と吻合 - 血管新生の主要な機能は - 示されています。
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この記事について
サマリー
要約
血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される、複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は次のとおりです。基底膜の分解、細胞外マトリックスへの内皮細胞の増殖と移行（萌芽）（EC）、コードへのECのアラインメント、分岐、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成を。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的アッセイ内の血管が頻繁にin vivoで血管似ていないされています。 NehlsとDrenckhahnによる以前の仕事に基づいて、我々は、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化されている。このモデルのすべての血管新生の主要な初期段階の反復するとは、重要なことは、血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。 ECはcytodexマイクロキャリア上に塗布し、フィブリンゲルに埋め込まれている。線維芽細胞は、それらがECはビーズの表面から発芽促進に必要な可溶性因子を提供するゲルの上に積層されている。数日後、数多くの血管が簡単に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察できる存在です。このビデオでは、これらの培養物をセットアップする重要なステップを示しています。
プロトコル
はPREPARING CELLS
- FBS /ペン - 連鎖球菌（1:100）1〜2日ビーズの前にM199/10％でHUVECと線維芽細胞を持ち出す。
- EGM - 2（Clonetics社）繊維芽細胞のために埋め込む前にHUVECと一日のためにビーズの前日に培地を切り替えます。
- 〜400 HUVECあたりビーズの濃度が必要です。
- よく20,000線維芽細胞が必要です。
HUVECでビーズコーティング - DAY -1
- HUVECをトリプシン処理。
- ビーズが沈殿することができます（遠心分離機しないでください！）。上清を吸引除去し、暖かいEGM - 2培地1mLで簡単にビーズを洗浄する。
- FACSチューブに暖かいEGM - 2培地を1.5mLのミックス2500ビーズのw / 1 × 10 6 HUVEC。インキュベーター内に垂直に置きます。 （これは〜10ウェルのために十分になります。必要に応じてスケールアップ）
- 管ごとに20分を振って、37℃で4時間インキュベートする。 （グッドコーティングが発芽するために重要です。）
- 4時間後、EGM - 2の5mLのでT25フラスコにコーティングされたビーズを転送し、O / Nを残す
0日目 - フィブリンゲルコーティングされたビーズを埋め込み
- 2.0 mg / mLのフィブリノーゲン溶液を（レシピの項を参照）を準備。
- フィブリノーゲン溶液にアプロチニン0.15単位/ mLを追加。
- 15mlのコニカルチューブにコーティングされたビーズを移し、ビーズは沈殿ができます。 EGM - 2と1.5mlの遠心チューブに移す液1mLに再懸濁し、ビーズ。
- ゆっくりと上下にペッティングによってEGM - 2液1mLで3倍ビーズを洗浄する。
- カバースリップ上ビーズを数えて、〜500ビーズ/ mLの濃度でフィブリノーゲン溶液に再懸濁します。
- 各ウェルにトロンビンの0.625単位/ mLを追加。
- 24ウェルプレートの各ウェルにフィブリノーゲン/ビーズ懸濁液0.5 mLを加え。
各ウェルのピペットチップを変更する！ - ピペットの先端で軽く〜4〜5回上下に移動してからトロンビンとフィブリノゲンを混ぜる。大きな泡を作るように注意してください。
- フードで5分間プレートを残し、その後血栓を生成するために10〜15分間37℃のインキュベーターに入れてください。
- 血栓を待っている間に、線維芽細胞をトリプシン処理。
- EGM - 2あたりも滴を1 mLを追加。
- ウェルあたり20,000細胞の濃度でフィブリンゲルの上にシードの線維芽細胞。
注意：
通常、フィブリンゲルを形成する際には、ゲルに小さな泡が表示されます。心配しないで、彼らは3-4日で消えます。
すなわち、2日目、4、6、など、一日おきにメディアを変更する..
3〜4日までに、発芽を確認して開始する必要があります。
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ディスカッション
in vitroでの血管新生アッセイにおける3次元（3D）は2Dの文化を使って達成できるよりも生体内で実際の環境にかなり近いですモデルを提供する成長コンセンサスがある。それは、優れた3Dシステムは再現性、及び血管新生の主要なステップのいくつかを模倣することができるはず明らかである。いくつかの以前の3Dアッセイが開発されているが、これらの多くは、いずれかを使用して、ハードを取得するために微小血管細胞を、または唯一のステージのいくつかを再現。このビデオでは、我々は説明し、血管研究で容易に入手し、最もよく使用されるECであるヒト臍帯静脈ECを利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化を実行。アッセイは、数日間にわたって、一貫して偏光ECに囲まれて透明な、特許細胞間ルーメンで長い船を再現。後でEC分岐と血管の融合（吻合）の段階でも観察されています。重要なことは、これらの培養でHUVECは発芽、遊走、整列、増殖、管腔形成、分岐と吻合を含め、in vivoまたはin vitroでのどちらか、微小血管ECで見られる形態学的変化のすべてを受ける。 HUVEC変化の遺伝子発現プロファイルは、並行して、より密接に微小血管ECのそれと一致する。結論として、我々はin vitroでの血...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 ビーズ | 試薬 | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/ボトル。1. 乾燥ビーズ 0.5 g を 50 mL の PBS (pH = 7.4) で室温で 3 時間以上水和・膨潤させる。50 mL チューブを用い、ロッカー上に設置する。2. ビーズを沈殿させる（約 15 分）。上清を捨て、新しい PBS (50 mL) で数分間ビーズを洗浄する。3. PBS を捨て、以下の濃度の新しい PBS に置換する：25 mL -> 20 mg/mL => 60,000 beads/mL または 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/mL。4. ビーズ懸濁液をシリコン処理ガラス瓶（Windshield Wiper または Sigmacote）に入れる。5. 115°C で 15 分間オートクレーブ滅菌する。6. 4°C で保存する。 |
| アプロチニン | 試薬 | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/ボトル。凍結乾燥アプロチニンを脱イオン水を用いて 4 U/mL に再構成する。滅菌フィルターを通す。1 mL ずつ分注する。-20 °C で保存する。 |
| フィブリノゲン I 型 | 試薬 | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g。フィブリノゲンを DPBS に 2 mg/mL で溶解する。凝固可能タンパク質 % を確認し、適宜調整する。37 °C のウォーターバスで加熱してフィブリノゲンを溶解させる。チューブを転倒させて混ぜる。ボルテックスは行わない。0.22 µm フィルターで滅菌ろ過する。 |
| トロンビン | 試薬 | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units。滅菌水を用いて 50 U/mL に再構成する。0.5 mL ずつ分注する。-20 °C で保存する。 |
参考文献
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
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