出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Summary

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述するサッカロマイセスセレビシエ。

Abstract

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する

Protocol

A.細胞培養やタンパク質誘導

このセクションでは、酵母細胞内の調節可能なプロモーターからタンパク質の発現誘導に続いて細胞の培養条件、ノコダゾールによる細胞周期の同期を、説明します。

1. 野生型の酵母株W303（LEU2 - 3、112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11、15）の制御下に興味のある私たちの遺伝子を含む高コピー（2μ）プラスミドDNA（ENTH2）で形質転換されメチオニン抑制性プロモーター（MET25）の。メチオニン欠く培地では最大発現を可能にしながらメチオニン2mMのは、プロモーター活性を抑制するのに十分です。したがって、メチオニン濃度の範囲は、所望のレベルでタンパク質を発現するために使用することができます。 W303細胞におけるプラスミドDNAの1トランスフォーメーションは、標準の手順に従ってLiAc - TE法を用いて行われる^2。
   注：この実験は唯一のバックグラウンドレベルでのタンパク質発現を確保するためにメチオニン2mmの存在下で一晩細胞を増殖させることによって実行する必要があります。翌朝、蛋白質の発現は、メチオニン直後に細胞周期の同期（約4時間）を欠く培地で細胞を再懸濁することにより誘発されるべきである。しかし、我々は、すべての症状の分析のために時間のコースを作り、ENTH2依存性の細胞分裂の表現型....

Discussion

このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒であるとしてちょうどイメージングの前に細胞を生きるに追加する必要があります。この手順は、簡単にターゲットを制御可能なプロモーターから発現される提供、蛋白質の抑制の条件下で観察表現型に適合させることができる。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ノコダゾール	試薬	Sigma-Aldrich	M1404
メチレンブルー 1% (w/v)	試薬	VWR 国際	VW6276-0
Calcofluor ホワイト	試薬	Sigma-Aldrich	F3543
ワセリン	試薬	VWR 国際	VW3339-2