でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

サマリー

アニマルキャップを過剰発現する遺伝子産物（s）を開発の側面に移植されていますアフリカツメガエル胚組織が決定されているかどうかを確立するため。

要約

多くのタンパク質は、胚発生における二重の役割を果たす。特定の組織の細胞の運命決定を制御するものも、胚の大きな領域の発展に影響を与える可能性があります。これは解析が困難、特定の組織にその役割を定義することができます。例えば、

プロトコル

パートI.は、ACTアッセイのセットアップが簡単にできます。

1. クロロホルム精製法（;アプライドバイオシステムズ/アンビオン、オースティン、テキサス州などmMessage mMachineキット）：自分のフェノールを使用して、製造元が推奨するように注射用キャップRNAを生成する。蛍光タンパク質をコードするRNAをトレーサーとして使用されます。私たちは、黄色蛍光タンパク質（YFP）またはpCS2 +発現ベクターになっているcDNAをmCherry ⁵のいずれかを書き写す。
2. マイクロピペットプラーを使用してテーパーガラスチップを形成するために、ホウケイ酸ガラス毛細管を引き出します。我々は、サターマイクロピペットプラー、P - 97（サッタインスツルメンツ社、ノヴァト、CA）を使用し、前述の^6を説明した。
3. KClを20mMの; 20mMのCaCl _2を 、50mMのHEPES、1MのNaCl、pH7.5に調整し、オートクレーブとに格納されている10 Xマークの修正リンゲル（MMR）ソリューション株式（10mMのMgCl ₂から表1の滅菌溶液を作るRT）。
4. 男性のカエルから精巣を分離し、1X MMR /ゲンタマイシン（50μg/ mlの硫酸ゲンタマイシン、BioWhittaker、猫＃17 - 518Z）の滅菌溶液に4℃で組織を保存する。これは、実験開始前の週までに行うことができますが、それは時間をかけてその効力を失いますている。
5. 産卵溶液（1X：150mMのNaCl、2.62 mMの塩化カリウム、0.8 mMののNa ₂ HPO _4、20mMのTrizma塩基、2.62 mMのNaHCO ₃と2.75 mMのMgSO _4を用い 、pHを7.6に調整）、8X株式として作ることができる4℃で保存することができます℃で最長2週間のための注記 ：このソリューションの汚染に注意、これは卵の品質に影響を与えるので。
6. 注入プレートを生成します。これを行うには、軽く泡を防止し、約のためにクールなように解決の上にエラストマー金型を（図1）アンロール、60 mmのプレートに〜6 mLの溶融アガロース溶液を追加し、電子レンジで0.4X MMRの1％アガロースを溶かす室温で20分。必要な数を決定するために、実験条件の数を考慮してください（ 例：1、YFP、2、YFP +ノギン）及び移植宿主胚の数が必要。我々の実験では、各実験条件に対して、少なくとも20移植宿主胚を生成する。 18〜19℃で、胚は1時間ステージ15になります。それは20の移植を実行するために一時間を要する場合、2つの受精時のポイントは、宿主胚はすべて移植を受け入れると仮定して、必要とされています。したがって、4つの注射の料理は（2のexpの条件× 2受精の時点= 4）必要になります。最大1週間までは4℃でプレートを保管してください。
7. 注入プレート用として金型を1％アガロース+ 0.7X MMRを使用してキャップの絶縁板を生成します。注入プレートを加えたつ余分あたり受精の時点（4 + 2受精の時点= 6）のようなキャップの分離の同じ数を作る。
8. 500台でマイクロインジェクションの前日に一日の後半にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを女性に注入する。 ℃で一晩16から18の雌を保管してください。

パートII。 アフリカツメガエルの胚のRNAのマイクロインジェクション

マイクロインジェクションのためのA.の準備

1. ホルモン誘発される女性を取り外し、1X産卵ソリューション（ELS）を含む個々のタンクの中に置いてください注意：私達は卵の質が低下するとELSで3つ以上の時間をされている卵を使用しないでください。そのため、 体外受精の前に約一時間、我々は唯一の新鮮な卵が収集されるように、タンクからすべての卵を捨てる。
2. 25〜35μmの直径を得るために先端をオフsnippingによってマイクロインジェクション用のニードルを準備します。 picoinjectorの上に針を置き、それが注射あたり10 NLを分配するようにそれを校正する。
3. 14℃にインキュベーターを設定する
4. かつて女性は約1時間、転送ピペットを使用してタンクから卵を除去すると60mmのペトリ皿にそれらを置くための卵を置いている。できるだけ卵から多くELSとして削除し、1X MMRと交換してください。卵は、すぐに受精または1時間まで1X MMRに滞在することができます。移植アッセイのために、それは周りの午前11時、正午と午後1時3つの別々のバッチまでの卵の単層の80％完全な2皿を、受精させる最善の方法です。注射の後、彼らは（;パートI、上記の＃6を参照ステージ15）14 ° Cは非常に彼らはキャップの分離（ステージ8.5〜9）と移植のための必要な段階に成長するとその時点で配置されます。
5. 精巣の品質を確認するには、我々は最初から精子が実行可能でない場合、私たちは別の男性から精巣を抽出することができる早朝の受精を（〜午前8時）、実行してください。注：我々は1 mLの1X MMRで〜0.25睾丸をホモジナイズし、卵母細胞のプレート当たり約5〜7滴を追加します。
6. in vitroでは時間後、均質化した精巣に卵を受精し、脱ゼリー液（164μl1M DTT + 10mLの1Mトリス、pH 8.8、50 mLのオートクレーブnanopureの水への）を使用して卵のゼリーのコートを脱ぐ。彼らは18℃でCまたは室温で1.5時間（22℃）を約2時間かかるソートを開始する2細胞期に達するまで待ちます。
7. TRANSFの使い方二ピペット、一様に色素ソートと均等に分割し胚は、として0.4X MMR + 6％フィコールで満たされた注射皿のウェルに、図3の左側のアニマルキャップに示す。

B.マイクロインジェクション

1. 60ミリメートルペトリ皿の蓋の上にパラフィルムを伸ばす。ピペットパラフィルム上に、最初のRNAサンプルを2μlと注射針を埋めるためにPLI - 100を使用して吸引除去する。針はまだ注射を開始する前に、サンプルの10 NLを調剤していることを確認してください。
2. 別の皿7の500の皿と、目的の遺伝子（例えば、20 pgのノギンRNA）のPG YFP RNAに加え、YFP RNA 20〜30 2細胞期の胚を（両方の割球）注入。
3. フィコール液で別の注射の皿の中で時間をポイントごとに100から200までの非注入胚を置きます。注入された胚と同時にinとoutインキュベーターのそれらを移動する。これらは、パートIVで使用されるホストです。
4. 注入後、14歳ですべての胚をインキュベート℃で一晩。すべての時間ポイントについて繰り返します。

パートIII。注入された胚から動物のキャップを分離する

1. 胚を上演するために早朝に到着する。早い時点ではステージ9になっているはず。生存しなかったものを削除します。バッチ内の各時点での作業は、次の手順に進みます。
2. 各プレートからフィコール溶液を捨て、バック0.7X MMR /ゲンタマイシン溶液を添加する。キャップの分離皿に、0.7倍MMR /ゲンタマイシンソリューションの寛大な量を追加します。作りたてのキャップの分離皿に転送ピペットと場所を使用してインジェクション皿の井戸から胚を押しのける。
3. ステージング用に2つまたは3つの完全な胚を保ち、0.7X MMR +ゲンタマイシン溶液中で動物のキャップを分離します。黄色の先端は400μmに曲げたり、鋭い番号5ピンセットを装着Gastromaster、どちらを使用することができます。
4. 次の日まで、14℃インキュベーターに戻しキャップを置く。宿主胚は、ドナーの組織と同じ発達段階でそれらを保つためにキャップと同時にインキュベーターから削除する必要があります。

パートIV。側面上にキャップの移植

1. 14℃インキュベーターからの最初の時点から、キャップや胚を取り出して、胚を上演。トレーサーの注入（図2）に応じて、均一な黄色または赤色蛍光陽性キャップの並べ替え、。
2. キャップの数をカウントし、0.7倍MMR /ゲンタマイシン溶液を新しく調製した注入皿にステージの数が12から13までの胚を二重削除。シャープ＃5鉗子で、それぞれから卵黄膜を除去。キャップ付きのプレートに移すが、注意してください。彼らの卵黄膜がなければ、胚は、すぐに水の表面で解離することができます。
3. gastromaster（黄色の先端、200 -250μm曲がった線、最高の設定）または＃5ピンセットを使用して、ステージ14から15（図3）における胚の辺上の正方形は200μmを削除します。その後、半分にキャップをカット（gastromasterまたは＃5ピンセット付き）とホスト胚に作られた穴にティッシュを置く。治癒を可能にするためによくに対する胚を回転させる。彼らがステージ15にあるときに、できるだけ多くの胚などに対してこれを行います。すべての時間ポイントについて繰り返します。
4. 胚は、通常30分以内に治るでしょう。 ＃5鉗子で穏やかなブラッシング運動と死細胞（白）を取り外します。 18 ° Cで一晩、それらを成長する。
5. 解剖蛍光顕微鏡、蛍光標識によるソートの胚、移植組織の下で。 18でそれらを戻す° Cステージ42から43まで成長する。
6. tricaineで動物を麻酔。この時点で、蛍光解剖顕微鏡下で写真を撮ることができます。設定が終了したら、セクションを修正し、免疫染色や、興味のあるあなたの組織のためのマーカーを用いてin situハイブリダイゼーションで行います。

図1。胚保持料理を作るために使用されるエラストマー金型を鋳造するためのプレキシガラスの設計 。 38 × 38ミリメートル丸三角四角（深さ〜5 mm）を50 × 50 mm角と厚さ25 mmであるプレキシガラスの部分からルーティングされています。円形、等間隔井戸（1.5 mmの直径）は、プラスチックへの深い1mmを掘削している。マイクロインジェクションの料理用エラストマー金型を作るために、我々は、製造元の指示に従って、プレキシガラスにSylgardエラストマーを注ぎ、それが固化することができました。このエラストマー金型を射出し、キャップ絶縁板を作るために使用されます。

図2。式が変化するように移植する前にソートアニマルキャップは、重要です。右側の外植片は、むらの式があり、破棄される間、左側のアニマルキャップが組織全体に均等にmCherry表現する。

図3。ホストtadpOLEが移植アニマルキャップ細胞からその山腹の目状の構造を開発しました。蛍光画像が明視野画像上にオーバーレイされています。

ディスカッション

このビデオでは、我々はアニマルキャップの移植アッセイを作成するために再配置アフリカツメガエルの生物学者によって使用される古典的なテクニック、私たちのバージョンを示している。室温では、 アフリカツメガエルの胚では、ステージ9と15を介して非常に迅速に開発する。 14 ° Cでそれらを置くことによって、胚の発達が遅くなると、より多くの移植が一つの実験で行うことができます。それは古い段階（> 43分の42）に胚を成長させる必要があるなら、私たちは、古いおたまじゃくしに注入された蛍光タンパク質の信号のフェードので、トランスジェニック金星YFPの動物を使用することをお勧めします。我々は眼様組織を形成するために指定されているEFTFsまたはノギンを発現する動物のキャップの組織を確立するために、このアッセイを使用していました。このアッセイは、目的の遺伝子（s）は、特定の細胞の運命を決定するために必要であるかどうかを確立するために簡単なテストとして使用することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
mMessage mMachine SP6 Kit	Applied Biosystems	AM1340
ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ (外径 1.0mm x 内径 0.5mm)	FHC, Inc.	27-30-1
Sutter マイクロピペットプラー	Sutter Instrument Co.	P-97
ゲンタマイシン硫酸塩 [50 mg/ml]	Fisher Scientific	BW17-528Z
Sylgard/エラストマーキット 1.1lb	Fisher Scientific	NC9644388
60 x 15 mm ポリスチレン製シャーレ	USA Scientific, Inc.	8609-0160
ヒト絨毛性ゴナドトロピン	Intervet Inc.	22219
Pico-Injector マイクロインジェクションシステム	Harvard Apparatus	650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm インキュベーター	Fisher Scientific	11-680-21
転送ピペット	Krackeler Scientific, Inc.	6290-20635A
Dumostar #5 ピンセット	Fisher Scientific	11295-10