このビデオでは、シロアリの後腸内に常駐微生物の種からDNAを抽出する手法を示しています。腸内の微生物群集を視覚化するのに便利ですウェットマウントスライドの準備も図示され、そして種が豊富な腸内環境を経由してツアーが与えられます。
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この記事について
サマリー
要約
シロアリは、単独で消費する木材によって内在する能力を持つことが知られているいくつかの動物の一つです。シロアリ腸管は主に酢酸にリグノセルロースの分解を補助する高密度と種が豊富な微生物群集が含まれている、シロアリの代謝を加速させる重要な栄養素（Odelson＆Breznak、1983）。これらの微生物集団内細菌、メタン生成古細菌と、いくつか（"低"）シロアリで、原生動物真核生物です。このように、シロアリは微生物種と彼らはホストの利益のために行う数々の生化学的機能間の相互作用を研究するための優秀な研究テーマです。シロアリの腸だけでなく、様々な生化学的プロセスに関与する重要な遺伝子の微生物集団の種組成は、分子技術を（。シュミット - Wagnerら、2003;。Salmassi＆レッドベター、2003工藤ら、1998）を使用して検討されている。これらの技術は、シロアリ腸内の環境から高品質の核酸の抽出と精製に依存する。 。Bertheletら、1996;。パーディら、1996;。Salmassi＆レッドベター、このビデオで説明されている抽出技術は、環境試料（モルら、1994からの核酸の抽出と精製のために開発されたプロトコルの変更をまとめたものです2003;。オッテセンら、2006）、それはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のテンプレートとして使用するのに適してシロアリの後腸の材料からDNAを生成します。
プロトコル
シロアリ全腸のDNA抽出のための手続き型の要約：
- 氷上で冷やしてシロアリは、滅菌ピンセットを用いて消化管削除し、バッファ内の腸のサンプルを安定化させる。
- PVPP / SDS /フェノールバッファーでサンプルをホモジナイズする。
- キアゲンDNeasyカラムを用いて粗ライセートからDNAを抽出し精製する。
プロトコル：
- 氷の上に、滅菌ピンセットを使用してワーカーカーストのシロアリから内臓を取り除く。
- すぐに50μLの氷冷した1 ×分子生物学グレードのTE緩衝液（1 mMトリス- HCl、0.1mMのEDTA、pH8.0）を含有する滅菌、ヌクレアーゼフリーのチューブに内臓との内容を転送します。 -20℃でサンプルを凍結、または均質化と直接進みます。
- 無菌ジルコニア/シリカビーズ500mgの（0.1 mm）を、1％w / vのポリビニルポリピロリドン（PVPPを含む1 × TEバッファー700μlのが事前にロードされた滅菌、ヌクレアーゼフリーの2 mlのスクリューキャップチューブに腸サンプルとバッファーを転送する）。
- 20％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を50μlとサンプルへのフェノールの500μlを添加します。
- 30秒の均質化の3サイクルと氷で冷却の30秒を使用して、最高の設定で（ビーズ拍）ホモジナイズする。
- 8000 x gで1分間堆積物不溶性物質。
- 粗溶解物の精製のために説明した方法を使用してQiagen社DNeasy列を含む水溶液（最）層の300μlをして浄化する。
- 後で使用するまで-20℃で核酸含有量および凍結試料を定量化する。
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ディスカッション
我々の経験では、Zootermopisのnevadensisのような木製の餌のシロアリの種の微生物群集から抽出したDNAは、抽出と精製1ラウンド後のPCRテンプレート用に十分に純粋である。しかし、このようなゴミ給と土壌栄養の種など、一部のシロアリはその腸の内容フミン酸の高い濃度を有することができるし、腸内微生物のDNAの追加の精製が必要な場合があります。 5 Z.のnevadensis労働者の内臓からの全DNAの収量は10〜30μgの範囲にある。この種よりも有意に小さくしたり大きくシロアリの種の場合は、より多くのまたはより少ない標本はDNAの同じような量を得るために必要になる場合があります。
このメソッドは、簡単にRNAの抽出を可能にするために適応させることができます。 RNAの抽出には、プロトコールのステップ2で説明した氷冷TEバッファにキアゲン（catlogない。76506）から1 × RNAprotectの細菌の試薬を代用。キアゲンをRNeasy試薬とカラムが（ない。74104をcatlogない）上記のDNeasy精製手順の代わりに使用する必要があります。 DNAとしてRNAprotect安定化サンプルと約わずか300μLから精製することができる。手順7で取...
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/phenol | 緩衝液 | ホモジナイズ緩衝液 | ||
| DNeasy Tissue Kit | キット | Qiagen | 77607 | 粗抽出液からのゲノムDNA単離プロトコル（製品マニュアル2003年7月版、付録H）に従って使用 |
| TE | 緩衝液 | Sigma-Aldrich | T9285 | 100x濃縮液から調製した1x緩衝液（1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0） |
| ジルコニア/シリカビーズ | 消耗品 | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | 試薬 | Sigma-Aldrich | P6755 | 乾燥試薬からTE緩衝液中で1x懸濁液として調製した1% w/v ポリビニルポリピロリドン |
| Zootermopsis nevadensis | 動物 | シロアリ | ||
| SDS | 試薬 | Sigma-Aldrich | L4390 | 乾燥試薬から調製した水溶液20% ドデシル硫酸ナトリウム |
| フェノール | 試薬 | Sigma-Aldrich | 77607 | TE飽和、~73% |
| MiniBeadbeater-8 | 器具 | Biospec Products | 963 | |
| BSS | 緩衝塩溶液, pH 7.2 | 1リットルあたりの組成：2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, および 1 M NaHCO3溶液 10 mL | ||
| AxioPlan-2 | 顕微鏡 | Carl Zeiss, Inc. | 40x対物レンズ、1.6x optivar、および10x接眼レンズを装備。サンプルは位相差照明を用いて観察した |
参考文献
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
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