以下のプロトコールは、膵臓の仮想スライスイメージングのための解剖、および全体の膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞のその後の定量化のプロセスを概説します。
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この記事について
サマリー
要約
健康と病気の特定の細胞集団の変化をトレースすると生物医学研究の重要な目標です。モニタリングの膵臓β細胞の増殖および膵島の成長のプロセスは特に困難である。我々はImageJ（rsb.info.nih.gov / IJ /）用に書かれたマクロを使用して蛍光タグ付きのβ-細胞とトランスジェニックマウスの無傷の膵臓のβ細胞の分布をキャプチャする方法を開発した。膵臓の解剖と組織の清算に続いて、全体の膵臓は、その後GFP -タグ付きβ-細胞が検討されている、仮想スライスとしてキャプチャされます。分析は、各島のためとβ-細胞の小さなクラスターのための特定のパラメータとの位置への参照を使用して、全β-細胞の面積、膵島の数とサイズ分布の定量化が含まれています。島の全体的な分布は、3次元にプロットし、各島のサイズと形状分布からの情報が一目で全体的なβ細胞面積の変化の定量的および定性的な比較を可能にすることができます。
プロトコル
第1部：試験片の調製
- 解剖顕微鏡下でマウスを置く、まだ接続されている十二指腸と脾臓と一緒に全体の膵臓を削除して、事前に計量したガラススライド上に臓器を置きます。それは膵臓にバインドされている側に沿って結合組織を切断して十二指腸を削除します。膵臓が完全にスライドで隔離されるまで、膵臓で脾臓や余分な脂肪をカットして取り外します。 （膵組織の少し暗いとタナー色から分化したと膵脂肪は、その白い色で区別できる。）
- それが完全に覆われるように膵臓上、カバースリップを（標準のカバーガラス25x75mm 50x75mm大型カバーガラス）に置きます。スライドとカバーの間に膵臓を平坦にする（重い本など）の重量を使用してください。重量に応じて、膵臓を平坦化すること約5分かかります。
- 重量をはずしなさい。膵臓は、スライドに対しても平坦化の場合は、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）に置きます。午前中は、カバーガラスを取り除き、よく日中のPFAに膵臓全体を（6-8時間）に公開。膵臓が十分に固定されていない場合、それは、長いPFAでおそらく一晩おくことができます。一晩（PBS）リン酸緩衝生理食塩水にトリトンX - 100 1％でコンテナにスライドを移し。翌日、1〜2日のために飽和ショ糖の容器にスライドを転送する。その後、蛍光シグナルの最適な解像度を可能にする組織がクリアされるまで100％のグリセロールの容器、にスライドを移転すること、組織の清算は、約1-3日かかります。 （蛍光シグナルは、数週間、....
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ディスカッション
無傷の膵臓のランゲルハンス島とβ細胞のクラスターの仮想スライス画像の解析は、島の全体の分布の大規模なビューを提供します。発展と時間をかけて合計膵島の分布の変化は、このように研究し、比較することができます。そのような例は、膵島の形成の分析（1）で示されています。様々な時点（P1 - P21）での新生児マウスの膵臓の包括的な分析は、島が分裂によって形成されることが実証されています。 β-細胞の増殖は、P12以降P1 - P10、膵島の分布から、マウスで対数正規確率密度関数でフィットしながら核分裂の過程を示唆し、対数正規分布のパターンから離れて左方向にずれる。同様の分析は、進行性のピーク位置とx軸のスケールのパラメータを持つ対数正規関数を装着したマウスのインスリノーマの開発、およびべき乗分布（2）上で行った。 
P（x）は=斧yを 。データを効果的に面積、周囲とフェレーの直径（図1E）.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
研究は、シカゴの糖尿病研究研修センター（動物モデルコア）、およびKovlerファミリー財団からの贈り物の大学に米国公衆衛生サービスグラントDK - 081527、DK - 072473とDK - 20595によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ピンセット | Miltex Inc. | ||
| はさみ | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| はさみ | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| 大型ガラススライド | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| 大型カバーガラス | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| ガラススライド | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| カバーガラス | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| カバーガラス | Erie Scientific | 25mm 円形 | |
| 蛍光顕微鏡 | Olympus Corporation | ||
| 解剖顕微鏡 | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP マウス | Jackson Laboratory |
参考文献
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. ....
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再版と許可
