初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。
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サマリー
要約
初期の脊椎動物の胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ゼブラフィッシュ胚、モザイク式の中のプラスミドDNAの結果の注入は、単一の細胞または細胞の小さなクラスターの可視化を可能に
プロトコル
1.Microinjection
- 希釈をコードするプラスミド膜をターゲットとした緑色蛍光タンパク質（MGFP、リチャードハーランドの礼儀）40 ng / mlの濃度に。 DNAはキアゲンのマキシプレップキットを使用して精製されたプラスミド（リチャードハーランドのmGFP/PCS2 +、礼儀）を線形化することによって調製される。ソリューションへのフェノールレッドの加算は、（総容積1 / 10に希釈）ソリューションを可視化することが好ましい。氷の上にDNA溶液を保管してください。
- 累進的なスライドに針を合わせ、静かにきれいなかみそりを使用して直径が1μm以下である針の部分をタップすることで、実体顕微鏡下で、注射針を（カタログ番号NA - GD - 1 Narishinge科学から90ミリメートルのガラスキャピラリー）キャリブレーションブレード（適当な大きさの先端を得るために）。
- ピース上に配置フェノールレッドと水を含む溶液の0.5μlを使用してニードルを記入し、フロント、知られているボリューム（2nl）を注入する針を較正するために、マイクロインジェクション装置（ハーバード大学の装置PCI 100マイクロインジェクター）に針を接続パラフィンの。解決策は、フットペダルを使用して省略することができる。 7 kPaに圧力を設定し、それが解決策の0.5μlディスペンス、250ペダルを取るように（10ミリ秒30msec）に変わる。
- 加湿100ミリメートルペトリ皿の中の....
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ディスカッション
結論では、標識技術は、ゼブラフィッシュ胚における形態形成のプロセスの単一細胞の分析を可能にするここで説明する。このプロトコルの主な重点は、ユビキタスプロモーターの制御下MGFPを使用して、神経管のイメージング標識細胞のための方法になります。この一過性発現アッセイのリーダーの追加のアプリケーション用にアンデルセンらによる最近の論文を参照する必要があります。3。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、R.ブリュースター（1R01GM085290 - 01A1）に授与されたNIHの助成金によって支えられている。
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材料
ソリューション
- ハンクの株式第1位：8.0グラムのNaClを100ml DD H 2 Oで0.4グラムのKCl
- ハンクの株式＃2：0.358グラムのNa 2 HPO 4、無水、100ミリリットルのddH 2 Oで0.60グラムのKH 2 PO 4
- ハンクの証券第4位：50ミリリットルのddH 2 Oで0.72グラムのCaCl 2
- ハンクの株式第5位：50ミリリットルDD H 2 Oで1.23グラムのMgSO 4 x7H 2 O
- 1 Xリン酸緩衝液：0.8％のNaCl、0.02％のKCl、0.02 M PO4、pH7.3に
- ブロッキング溶液：2％正常ヤギ血清、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、1％dimethysulfoxide（DMSO）
参考文献
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain
Posted by JoVE Editors on 9/16/2010. Citeable Link.
A correction was made to Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County
2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2
1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
