細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Summary

このビデオでは、細胞の効率的な電気融合を示しています in vitroでエレクトロポレーションおよび蛍光顕微鏡による融合細胞の可視化のその後の検出を使用して変更密着法による。

Abstract

細胞の電気融合は、ヒト​​の治療のためのハイブリッド細胞を調製するために使用することができる安全な、非ウイルス性および非化学的な方法です。電気融合は密着している細胞に短い高電圧の電気パルスのアプリケーションが含まれます。短期、高電圧の電気パルスのアプリケーションは、細胞の形質膜の不安定化を引き起こす。不安定化膜は、異なる分子のため、より透過性とは、近接する不安定化膜との融合にもなりやすいです。電気融合は、このように非常に異なる細胞の非特異的な融合を実現する便利な方法です。

Protocol

I.はセルトラッカーCMFDAとCMRAで細胞をロードする

1. 実験は、マウスのメラノーマ細胞株（B16 - F1）の事前に準備された細胞について実施した。細胞は、投与16、0.15 mg / mlのL -グルタミン、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で70〜80％コンフルエントになる2つの分離25cm ^2の培養フラスコ（TPP、ZDA）で栽培されています/ mlのゲンタマイシン（Sigma - Aldrich社、ドイツからのすべて）、200単位/ ml crystacillin（Pliva、クロアチア）、および37℃、5％CO ₂でインキュベート℃の
2. オリジナルの染料の50μgのために（Sigma - Aldrich社、ドイツ）のDMSO（グリーンCMFDA用とオレンジCMRAため、それぞれ）10.76μlを、9μlを添加して細胞のトラッカー（インビトロジェン社、米国）の2つの10 mMのストック溶液を準備するインビトロジェンのバイアル。ストック溶液は、℃で数ヶ月間で4冷蔵庫で保存することができます。 DMSOの結晶が溶解するまで実験を開始する前に、ソリューションのウォームアップを行います。
3. 重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液（130 mMのNaCl、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのMgSO _4を 、1.2 mMのKH ₂ PO _4、29.6 mMのD -グルコース、1.3 mMのCaCl _2を 、10mMのHEPES、pH7.4）を準備する。 2つの15エッペンドルフチュー​​ブに別々に重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液3mlに各ストック溶液2.1μL（それぞれ10 mMのCMFDAまたはCMRAを、）ミックス。これは約7μMCMFDAを（またはCMRA）を含む"ローディングソリューション"を得られます。
4. 重炭酸フリークレブス- HEPES緩衝液で細胞を2回リンスし、フラスコにソリューションを読み込んで挿入。 37℃5％CO ₂で30分間細胞をインキュベート℃にこの最初のインキュベーションの試薬は、細胞膜を自由に通過する時には、いったん細胞の中に、試薬は、細胞非透過性の蛍光反応生成物に変換されます。
5. 37で最初のインキュベーションの後、リンス、5％CO ₂でさらに2時間培養培地で細胞をインキュベート℃に
6. 両方のフラスコに細胞をトリプシン処理（CMFDAとCMRA搭載）および50 ml遠心チューブに比1:1（TPP、ZDA）で一緒に赤と緑のセルを混在させること。 DMEM培地で希釈することによりまたは遠心分離による濃縮により、5 × 10 ⁶細胞/ mlに細胞濃度を調整します。 24マルチウェルプレート（TPP、ZDA）の各ウェルに細胞懸濁液の20μlのドロップを置きます。 ℃で20分間、ややもの表面に付着し、細胞の接触を確立できるように37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートする。

II。電気融合

1. isoosomolarリン酸カリウム緩衝液（10mMのKH 2 PO 4、10mMのK ₂ HPO _4、1mMのMgCl _2を 、250mMスクロース）とhypoosmolarリン酸カリウムバッファー（10 mM KH 2 PO 4、10mMのK ₂ HPO _4、1mMのMgCl _2を 、75 mMスクロース）の準備。
2. 、顕微鏡ステージ上に細胞をマルチウェルを配置ウェルの下部に位置電極を、パルス発生器に接続します。
3. isoosomolarリン酸カリウム緩衝液1mlで細胞を洗浄。細胞の腫脹を誘発するためにhypoosmolarリン酸カリウム緩衝液350μlを添加します。バッファは、電極をカバーする必要があります。
4. 電気パルスを適用する前に2分間hypoosmolarバッファーで細胞を残す。この時間の間にインテリアや細胞の外側との間の浸透圧の不均衡に起因する細胞内への水分の流入は、細胞容積の増加を引き起こす。細胞は彼らの最大のボリュームに近づく際には、電気パルスが調節容量の減少を開始する前に、適用する必要があります。
5. 最適な電気融合を実現し、細胞の生存を維持するために、電気パルスの最適なパラメータを使用する必要があります。これらは、[1]を使用する細胞株に依存する。この実験では、8の矩形パルス（1 Hzで100μsの間の持続時間と各）の列車は、エレクトロポレーションのデバイスを（このケースCliniporator、ジェーア、イタリア）を使用して、各サンプルに適用されます。パルスは、よく制御を除いて、各ウェルに電極間に約1200 V / cmの電場を作る、0.8mmの直径とそれらの間に5 mmの距離で二つの平行な白金/イリジウムワイヤー電極に配信されます。
6. パルスの配達後10分間静細胞を残す。蛍光および位相差顕微鏡による核融合の利回りを決定します。

III。画像取り込みと融合の収量の決定

1. 細胞は、目的（x20）をと冷却CCDカメラ（VisiCam 1280、Visitron、ドイツ）を装備した蛍光顕微鏡を（我々の場合ツァイスAxioVert 200、ツァイス、ドイツ）を用いて観察される。画像は、MetaMorph 7.1.1（Molecular Devices社、米国）に買収されていますが、他の同じような買収のソフトウェアを使用することもできます。 CMFDAは548 nmで492 nmの単色光分光器（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）とCMRAで興奮している。 CMFDAとCMRAの蛍光は（D605/55m、Cの2つの発光535 nmの中心フィルター、つ（HQ535/30m、CMFDA用）と510nmで他の中心を使用して取得されるMRA、クロマ、米国）の両方。ダイクロイックミラー（Q515LP）を使用すると、チャンネルのクロストークを防止。
2. 各ウェルに5つのランダムに選択されたフィールドには3つのイメージを（位相コントラスト、赤色および緑色蛍光）を取得。各画像の三つ組から3チャンネルの画像を作成します。そのようなイメージでは蛍光を発する細胞質は細胞膜と一緒に見ることができます。融合細胞は、このように容易に決定することができます[図1]。
3. 各3チャンネルの画像で細胞（赤、緑、二重に蛍光）の3種類すべてをカウントします。各画像のすべてのセルの数を二重に蛍光細胞の数を割ることによって二重に蛍光細胞の割合を決定する。核融合の利回りは、融合細胞の半分から2を乗じて二重に蛍光細胞が（同じ色のヒューズの際の細胞）が検出されていないのパーセンテージとして定義されています。

代表的な結果

図1電気融合後のB16F1細胞の3チャネルの顕微鏡像：。位相コントラスト、CMRA蛍光（548 nmで励起）とCMFDA蛍光（492 nmで励起）、客観的な倍率20倍

Discussion

非特異的に、例えば、外部電界によっては、融合する細胞膜の能力は、生物学、バイオテクノロジー、医学研究のために重要です。このような非特異的な融合は、例えばモノクローナル抗体のような非常に貴重なハイブリッド細胞とその製品の生産を可能にし、[2]核融合の基本的メカニズムに関する情報を提供します。それが適切に異なる種類の細胞に調整できるので、電気融合は、潜在的に非常に効果的な方法です。密接な物理的接触で細胞を高電圧の電気パルスによって彼らの融合状態（核融合を起こしやすい）に持って来られるときに電気融合が達成されます。電気融合の効率は、電気融合過程の二つの部分に影響を与えるさまざまなパラメータに依存します。電気融合過程の最初の部分は、細胞間の緊密な物理的な接触の成果であり、これは別の方法で得られる[3-8]。密着法（コンフルエンスまで増殖する細胞）が原因で細胞間の大きなゾーンで自発的に確立されたセルの連絡先に効率的に使用できますが、それは多くの原子核で非常に大規模な融合細胞を生成します。我々は生き残るために可能性が高いと増殖する小さな細胞が（2〜5核をもつ）、、得られる改変遵守方法を、（図1）を使用している。細胞間の接触は、また実験[9]で使用される浸透圧処理により、細胞の浸透圧膨張の恩恵を受ける。電気融合プロセスの後半では、細胞膜の融合状態を達成することである。融合状態は、膜のelectropermeabilized状態（細胞が非特異的に、通常はそのままに膜を通過できない分子に透過処理したもの）とよく相関し、電気パルス（振幅、長さ、数と周波数）の同じパラメータによって支配される[10] 。最適なエレクトロポレーションに必要な電気的パラメータの値が[1]と電気融合が異なるセル間で異なると細胞の大きさとその生物学的特性に依存する。電気的パラメータは、このように融合を得るために、融合パートナーとして使用されるさまざまな細胞株に最適化する必要があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	試薬	Invitrogen	C34551	サイトゾル蛍光色素
CMFDA	試薬	Invitrogen	C7025	サイトゾル蛍光色素
DMSO	試薬	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	試薬	Sigma-Aldrich	D5671	ダルベッコ'修正されたイーグル」中型
子牛胎児血清	試薬	Sigma-Aldrich	F4135
L-グルタミン	試薬	Sigma-Aldrich	G7513
クリスタシリン	試薬	Pliva	625110	抗生物質
ゲンタマイシン	試薬	Sigma-Aldrich	G1397	抗生物質
Hepes	試薬	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	試薬	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	試薬	Sigma-Aldrich	M2643
D-グルコース	試薬	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	試薬	Sigma-Aldrich	C4901
スクロース	試薬	Sigma-Aldrich	16104
電気パルスジェネレーター	ツール	IGEA		Cliniporator VITAE
マルチウェルプレート	テク	ノプラスチック製品	92424
50 ml 遠心分離管	ツール	テクノプラスチック製品	91050
15 ml 遠心分離管	ツール	テクノプラスチック製品	91015
25 cm2 培養フラスコ	ツール	テクノプラスチック製品	90026
電極	ツール	カスタムメイド		PT/IR