成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

このプロトコルは、Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. D. melanogasterの成体脳の顕微鏡スライドへのマウントとイメージング

1. 「ブリッジ」スライドを作成します。2つの「ベース」カバースリップを約1cm離して、正に帯電したスライドに配置します。スライドの正に帯電した面が上を向いていることを確認します。カバースリップをマニキュアでスライドに接着します。これは図 1 A で示されています。通常、各ベースカバースリップの3つの外縁をマニキュアでシールして、封入剤がこれらのベースカバースリップの下に吸い付かないようにすると便利です。先に進む前に、マニキュアを完全に乾かします(10〜15分)。
2. スライドを実体顕微鏡の下に置き、解剖した脳を含む封入剤溶液を2つのカバースリップの間のスペースにピペットで移します。コントラストを高めるには、グースネックライトをベンチトップと平行になるように操作すると便利です。
3. ピペットを使用してスライドから余分な封入剤を取り出し、スライドから脳をピペットで動かさないように注意してください。
4. 余分な封入メディアを吸い取ります。これにより、次のステップで脳をより正確に配置できるようになります。
5. 一対の鉗子と実体顕微鏡を使用して、触角ローブが上を向くように、脳をスライド上にグリッドパターンで配置します。
6. カバースリップ (「ブリッジ」) を脳の上に置きます (図 1A)。マニキュアを使用して、ブリッジカバースリップの側面が「ベース」カバースリップに接触する場所をシールします。
7. p200ピペットを使用して、ブリッジの下の中央キャビティに新しい封入剤をゆっくりと充填します(図1B)。センターカバースリップのオープンエッジに一度に1滴ずつ置き、封入剤がセンターブリッジカバースリップの下に吸い付くようにします。キャビティ全体が封入剤で満たされるまで続け、次に透明なマニキュアで上部と下部を密封します。
8. マニキュアが乾いたら、すぐにスライドをイメージするか、-20°Cの耐光性に優れたタイトなスライドボックスに保管します。
9. 1週間以内に、選択した蛍光二次抗体に適した励起レーザーとフィルターキューブを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して脳を画像化します。キノコ体ニューロンのZスタック画像は、通常、20倍または40倍の対物レンズを使用して取得されます。網膜視細胞ニューロンのイメージングには、より高い倍率が必要になる場合があります。

図1:免疫蛍光イメージングの準備のための脳のマウント。(A)脳は、脳の平ら化を防ぐためにブリッジカバー付きのSuperFrost Plusスライドに取り付けられています。2枚の「ベース」カバースリップをSuperfrost Plusの正に帯電したスライドに接着し、透明なマニキュアを塗った状態で解剖した脳をスライドの上に置きます。透明な「ブリッジ」カバースリップを脳の上に配置し、ベースカバースリップに接着します。(B)マニキュアが乾いたら、Vectashieldをブリッジの下にゆっくりとピペットで入れて、二次抗体の蛍光を維持します。次に、透明なフィンガーマニキュアを使用して、「ブリッジ」カバースリップの上部と下部をシールします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。