線虫の凍結亀裂:染色のために内部の線虫組織を露出させる方法

要約

出典:Zhang, N., et al. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-Function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (2017).

この動画では、キューティクルを破壊することでC.エレガンスの組織を抗体染色に利用できるようにする方法であるフリーズクラッキングについて説明しています。

プロトコル

このプロトコルは、Zhang et al, The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-Function Analysis and Imaging, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

C.エレガンス腸の抗体染色

1. 固定
   1. きれいなスライドガラスを取り、ポリ-L-リジンを使用して、線虫が付着するための薄膜を生成します。スライド上に30 μL 0.1-0.2% poly-L-lysineをセットし、2枚目のスライドをpoly-L-lysineドロップにセットして「サンドイッチ」を作ります。次に、スライドを数回優しくこすって両方の表面全体を濡らし、30分間自然乾燥させます。スライドのつや消し面に鉛筆でラベルを付けます.
      注:200μLの0.2%ポリ-L-リジンアリコートは、粉末をdH₂Oに溶解することによって作成されました。これは-20°Cで保存でき、高分子量のポリ-L-リジンを使用して、ワームの粘着性を改善します。ポリ-L-リジンの濃度も重要です。濃度が低すぎると線虫が付着しませんが、高濃度すぎると蛍光バックグラウンドシグナルが生成される可能性があります。厚すぎるフィルムは、全体が緩む可能性があります。
   2. 液体窒素で満たされた容器(ポリスチレン容器など)の底に平らな金属ブロックをしっかりと置きます.
      注:代わりにドライアイスを使用することもできますが、液体窒素は容器の底の金属ブロックをより安定させ、よく冷やします。
   3. M9でプレートからワームを洗い流してワームを集めるか、各スライドに異なるステージのワーム(卵、L1、L2、L3、またはL4幼虫ステージのワーム)を選びます。通常、各スライドには~100匹の幼虫と胚、または~20匹の成虫を選びます。洗い流した10 μLの線虫をスライドの中央に置くか、卵/線虫を10 μL M9または10 μL 1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に選びます。
      1. ピペットを使用して多数のワームを広げ、凝集を防ぎます。
         注:洗い流されたワームの混合集団は、混雑とステージの厚さの違いにより、うまくくっつかず、凍結クラックの効果が低くなります(以下を参照)ため、ステージ固有のワーム(または同期された集団)を選択すると、優れた結果が得られます。幼虫は成虫よりもくっつきやすく、スライドごとにより多くの動物を配置できます。
      2. 線虫をスライドにピッキングする前に、OP50細菌を含まない線虫増殖培地(NGM)プレートに移します。ワームに付着した過剰な細菌も、付着を妨げる可能性があります。ワームが乾かないように注意してください。
   4. 収集したワームの上に22mm×22mmのカバースリップを横方向にそっと置き(落とし)、その端がスライドの少なくとも片側にぶら下がるようにします。カバースリップを1本または2本の指で優しく、しかししっかりとまっすぐ押し下げます。組織の完全性を損なうようなせん断は避けてください。
   5. スライドを液体窒素中の金属ブロックにすぐに静かに移し、約5分間放置して凍結させます。次に、張り出した端を使用して、カバースリップを1回の素早い動きで「はじき」ます。
      注:このステップは、キューティクルの「ひび割れ」を達成するために、スライドが凍結している間に決定的に行う必要があります。注意:液体窒素を取り扱う際は、PPE(個人用保護具)のガイドラインに従ってください。
   6. 凍結分解したスライドをメタノール充填ガラスCoplinジャーに-20°Cで5分間浸します。次に、アセトンを充填したガラス製のCoplinジャーに-20°Cでさらに5分間移します
      注:メタノールとアセトンは、使用前に少なくとも-20°Cで30分間保存する必要があります。固定後、スライドは-20°C.
      で保存できます 注意:メタノールとアセトンは有毒です。
   7. スライドを瓶から取り出し、室温(RT)で風乾させてから使用してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体染色
poly-L-lysine	シグマ	P5899
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A452-4
アセトン	フィッシャーサイエンティフィック	A949SK-4
パーマウント	フィッシャーサイエンティフィック	SP15-100
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	4448
顕微鏡カバースリップ(22x22-1)	フィッシャーサイエンティフィック	12-542-B
M9 ミディア			ラボメイド
OP50バクテリア	CGCの