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このプロトコルは、Tauc et al., Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging, J. Vis. Exp. (2014)からの抜粋です。
注:このプロトコルを初めてFACソーティングによってISCを分離する場合、FACSパラメータを適切に初期設定するためには、次の制御が必須です:野生型(例:w1118)からの解離細胞、Sytoxを含まないショウジョウバエの中腸。野生型(w1118など)ショウジョウバエの中腸からSytoxで解離した細胞(ステップ3.6を参照)。esg-Gal4、UAS-GFPフライラインの中腸からの解離細胞、Sytoxなし。
1. 腸内解剖のための溶液と皿の準備
- esg-Gal4、UAS-GFPフライラインからの40匹の雌ハエをそれぞれ含む4〜6バイアルを準備します。
- 10x PBSストック溶液から、1x PBS(1.8 mM NaH2PO4·H2O、8.4 mM Na2HPO4·2H2O、175 mM NaCl、pHを7.4に調整)を500 mL調製します。
- 1x PBS(1x PBS中に3.5 g電気泳動グレードのアガロース)に3.5%アガロース溶液を調製します。この溶液をシャーレ(直径8.5cm)に注ぎ、底を覆って解剖プレートを準備します。アガロース層は、解剖処置中に鉗子の先端を損傷するのを防ぎます。ゲルが固まったら、解剖プレートを4°Cで保存します。
- 解剖する前に、1x PBS + 1% BSAを300 mLフレッシュに調製し、ボトルを氷上または4°Cに置きます。
- 遠心分離機の電源を入れ、4°Cに冷まします。
- 2つのガラスパスツールピペットの先端に火をつけて、端を滑らかにします。
- 2組の鉗子と1組のカミソリの刃を70%エタノールで洗浄します。
- 解剖した中腸を氷上に収集するために、1.5 mlの微量遠心チューブを4〜6本入れます。
2. 消化管の準備と中腸の解剖
- 麻酔は、標準的なフライベッド上のCO2を含む1つのバイアル(40匹のハエ)からハエをはね、かみそりの刃を使用してすべてのハエを斬首し、それらを解剖皿に移します。冷たい1x PBS/1% BSA溶液を解剖皿に注ぎ、アガロースゲルを覆います。ハエが浮かびます。
- 一方の鉗子でハエの腹部をつかみ、もう一方の鉗子で胸部を保持します。胸部を腹部から分離します。腸が見え、前腸/作物はまだ胸部に接続されている可能性が高いです。
- 腸をつかんで胸部から引き抜きます。腸を広げるには、作物をつかみ、腸を腹部から少し前方に引き離します。
- 腹部の後端を1対の鉗子でつかみ、前方に開いたキューティクルの端をもう一方の鉗子でつかみます。突き出た腸組織を壊さないように注意してください。後端を引っ張ってキューティクルを壊し、腸全体が腹腔から引き抜かれるまで後端を非常に穏やかに引っ張り続けます。作物が大きすぎて体腔に収まらない場合は、事前に取り除かなければならない場合があります。
- 前腸、マルピーギ尿細管、後腸、卵巣を切除し、むき出しの中腸を残します。
- ガラス製のパスツールピペットを使用して、解剖した中腸のバッチを冷たい1x PBS/1% BSA溶液が入った1.5 mLの微量遠心チューブに移し、チューブを氷上に保ちます。サンプルは2時間以内に処理する必要があります。
- バッチ全体の解剖が完了したら、解剖皿を二重蒸留水ですすいで、残った破片を洗い流します。次の中臓のバッチの解剖を開始します(手順2.1〜2.7を繰り返します)。2時間以内にできるだけ多くのバッチを解剖し、ステップ3.1に進みます。
3. FAC選別のための細胞採取のための腸組織の消化
- 1x PBS/1% BSA溶液を中腸から取り出し、各サンプルに500 μlの0.5% Trypsin-EDTA溶液を加えます。
- 20秒間ボルテックスウェルで培養し、室温で20rpmで25〜30分間穏やかに揺動/回転させてサンプルをインキュベー
トします。
- 約30分後に再びボルテックスし、無傷の中腸組織をチューブの底に沈めます。懸濁液中の細胞を炎状ガラスパスツールピペットで慎重に取り出し、35μmのナイロンメッシュでろ過して新しい1.5mlの微量遠心チューブに入れます。
- 細胞を100 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。注目すべきは、消化を開始するとき、細胞ペレットは最初は見えないかもしれませんが、組織消化が進行するにつれて見えるようになることです。
- トリプシン溶液を、残りの無傷の中腸組織を含む元のサンプルチューブに慎重に移します。ペレットから細胞を移しすぎないようにしてください。
- 細胞ペレットを400 μlの冷冷1x PBS/1% BSAに穏やかに再懸濁します。解離した細胞が入った微量遠心チューブを氷上に置き、チューブをアルミホイルで覆って細胞を光から保護します。
- 残りの無傷の中腸組織を含むトリプシン溶液を再度ボルテックスし、サンプルをロッカーに室温でさらに30分間置きます。
- すべての中腸組織が消化されるまで、手順3.3から3.4.3を繰り返します。すべての微量遠心チューブから解離した細胞を1本の微量遠心チューブに結合します。これには、3.4のような遠心分離ステップが必要な場合があり、これは、結合されたすべての細胞懸濁液の容量が1.5 mLを超える可能性があるためです。細胞懸濁液を氷上に保管し、細胞を光から保護します。
- 解離した細胞を100 x gで5分間、4°Cでスピンダウンし、上清をできるだけ慎重に取り除き、微量遠心チューブに約50-100 μlの1x PBS/1% BSA溶液を残します。解離した細胞を、Sytox (1:20,000) を含む 800 μl 1x PBS/1% BSA に穏やかに再懸濁します。
- 細胞懸濁液を5 mLの丸底Falconチューブに移し、セルストレーナースナップキャップ(35 μmナイロンメッシュ)で細胞をろ過します。細胞サンプルは常に氷上に保ち、光から保護します。これで、セルを並べ替える準備が整いました。
- 600 μlのRNAlater溶液を各微量遠心チューブにピペットで入れ、その後のRNA単離のために細胞を選別します。他のダウンストリームアプリケーションでは、細胞を別の溶液、例えば滅菌PBSで収集することができます。