寿命分析:C.エレガンスの寿命の測定

Abstract

出典:Cornwell, A. B., et al.レプリカセット法:線虫の寿命を定量的に測定するためのハイスループットアプローチ。 (2018年)。

このビデオでは、C. elegansの寿命を測定する伝統的なプレートベースの方法を説明しています。このプロトコル例は、RNAiで処理された線虫の寿命を測定します。

Protocol

次のプロトコルは、Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018) からの抜粋です。

1. 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) の添加による子孫生産の防止

1. 播種後約40時間後に同期動物がL4に発達したかどうかを確認します(ステップ2.1.7).
   注:C.エレガンスの発生時間は温度によって異なり、成長率が特徴化されていない突然変異動物の成長率は経験的にテストする必要があります。
   1. L4動物を入れた各6cmプレートに160μLの50x FUdRを加えます。
      注:L4ステージでFUdRを追加することが重要です。便宜上、1 g の FUdR を 10 mL の超高純度 H₂O に溶解して FUdR の 1,000 倍ストックを作成し、0.2 μm フィルターと 10 cc シリンジでストック FUdR をフィルター滅菌します。~1 mLのストックを滅菌済みの1.5 mLチューブに分注します。凍結して-20°Cで保存します。
2. プレートにオスのC.エレガンスがいるかどうかを点検します。すべてのオスを取り除きます。
   注: 寿命は通常、雌雄同体で測定され、男性では測定されません。交尾する雌雄同体は、FUdRの存在下でも、交配していない動物よりも短命です。オスは雌雄同体よりも小さくて細く、独特の鉤状の尾で簡単に識別できます。
3. 箱をジップロックバッグに戻します。20°Cインキュベーターに戻します。

2. 採点の実行可能性

1. プラチナワイヤーまたはまつげで動物の頭に優しく触れることにより、毎日生存率をスコアリングします。動かない動物を死者として採点し、プレートから取り除きます(図1A)。各観測時点について、各条件で観測された死亡者数を記録します。
   注:採点バイアスのリスクを減らすために、実験者は実験条件に対して盲目であり、同様に採点中に前の時点の結果を参照してはなりません。
2. 破裂した動物、他の明らかな発達障害で死亡した動物、または皿の側面に這い上がった動物を検閲します:これらの動物を取り除き、統計分析で考慮するために観察された各時点での数を記録します。さらに、オスが見つかった場合は、それらを削除し、観察された数を記録します。
3. 動物が生き残らなくなるまで、ステップ2.1から毎日繰り返します。
   注:大腸菌の芝生が著しく減少した場合、またはプレート上で真菌が成長し始めた場合は、残りのすべての動物を適切なRNAiとFUdRを使用して新しいプレートに移します。

Results

図1:C.elegansの寿命をスコアリングするための従来の方法とレプリカセットの方法 (A)。C.elegansの寿命をスコアリングするための従来の方法。条件ごとに同質遺伝子動物のいくつかの小さな同期集団を経時的に追跡します。学習コース全体を通して、同じ動物の集団が追跡されます。生存率は動きによって評価されますが、動きは穏やかな突っ込みによって刺激される場合があります。動かなかった動物は死亡した動物として採点され、生存可能な動物がなくなるまで取り除かれます(誤嚥が示されています)。 (B). C. elegansの寿命を採点するためのレプリカセット法。年齢同期した同質遺伝子動物の大規模な集団が、多数の同一の複製プレートに分布しています。各時点で、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-フルオロ-2'-デオキシウリジン)	アルファ・アエサル	L16497
24ウェルカルチャープレート	グライナーバイオワン	#662102
600 μL 96ウェルプレート	グライナーバイオワン	#786261
2mL 96ウェルプレート	グライナーバイオワン	#780286
96ピンプレートリプリケーター	ヌンク	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- アーリンガー	出典:Bioscience	C. elegans RNAiコレクション (Ahringer)	Kamath et. al, Nature 2003も参照。
C. elegans RNAiクローンライブラリ HT115 bacteria- Vidal	出典:Bioscience	C. elegans ORF-RNAiリソース (Vidal)	Rual et. al, Genome Research 2004も参照。このライブラリはDharmaconからも入手できます。
L4440空のベクタープラスミド	アドジーン	1654	https://www.addgene.org/1654/