酵素消化と手動解離:細胞培養のためのC.エレガンス胚の調製方法

要約

出典:Sangaletti, R. and Bianchi, L. A Method for Culturing Embryonic C. elegans cells.J. Vis. Exp.(2013年)。

この動画では、C.エレガンス胚の細胞をin vitroで単離し、無菌培養する方法を紹介しています。

プロトコル

1. 胚細胞の解離

1. 無菌条件下で、層流フードを使用して手順の次のステップを実行します。動物はバクテリアプレートにガウンを着ていますが、洗濯と漂白剤を含む溶解液での処理により、すべてではないにしてもほとんどのバクテリアが除去されます。したがって、手順のこの時点で層流フードを使用すると、卵懸濁液の新たな汚染を防ぐことができます。
2. ペレット卵を1 mlの2 mg / mlキチナーゼ(卵緩衝液pH 6.5にストック)に再懸濁し、新しい滅菌15 mlコニカルチューブに移します。.チューブを室温で10〜30分間揺さぶります。正確なインキュベーション時間は、酵素の鮮度と部屋の温度によって異なるため、調製ごとに決定する必要があります。インキュベーション後、倒立型細胞培養顕微鏡で卵子のモニタリングを開始することをお勧めします。注:私たちの経験では、pHが低いとキチナーゼの酵素活性が増加します。このため、キチナーゼを溶解するためにpH 6.5の卵緩衝液を使用します(上記のレシピで、NaOHを使用してpHを6.5に調整します)。
3. 卵殻の~80%がキチナーゼ処理によって消化されたら(図1 A-B)、卵を900 x g(~2,500 rpm)で3分間遠心分離してペレット化します。P1000ピペッターと滅菌チップを使用して、上清を慎重に取り除き、L-15培地3 mLを加えます。
4. 卵子を直径6cmのプレートに移し、18Gの針を備えた10mlの滅菌注射器を使用して細胞を穏やかに解離します。新鮮なプラスチック製のペトリ皿に懸濁液を一滴入れ、顕微鏡で観察することにより、解離の程度を監視します。この手順では、細胞の損傷を避けるために、シリンジに空気を吸引しないでください。細胞の~80%が解離するまで解離を続けます。
5. 滅菌済みの5 μmミリポアフィルターを使用して懸濁液をろ過します。細胞の塊、未消化の卵、孵化した幼虫を取り除くために、細胞懸濁液をろ過する必要があります。追加の4〜5 mlの新鮮なL-15培地をフィルターでろ過して、すべての細胞を回収します。フィルターやセルの損傷を避けるために、ろ過ステップ中に過度の力を加えないでください。

2. 細胞の培養

1. 解離した細胞を900 x g(~2,500 rpm)で3分間遠心分離し、P1000ピペッターと滅菌チップを使用して、すべての上清を慎重に除去します。ペレット化した細胞を完全なL-15培地に再懸濁し、1 mL/ウェルをプレート化します。8Pの数により、媒体の添加量が異なります使用するプレート、プレート上の線虫の合流点、および細胞に対して行われる実験の種類。細胞密度は、血球計算盤を使用して決定できます。パッチクランプ記録の場合、めっき密度は~230,000細胞/^cm2が最適です。
2. 24ウェルプレートは、培地の蒸発を防ぐために、濡れたペーパータオルが入ったプラスチック製のタッパーウェア容器に保管してください。容器は、20°Cの加湿インキュベーターに保管し、周囲空気に入れます。
3. 細胞は通常、GFPマーカーの形態学的分化と発現が完了してから24時間以内に実験の準備が整います。細胞は最大2週間培養することができますが、通常はプレーティング後7〜9日が最も健康です。培地は、健康な細胞を維持するために1日1回交換する必要があります。

結果

図1.キチナーゼ治療前後のC.エレガンスの胚。(A)キチナーゼに曝露する前の卵の写真。矢印は、胚を囲む透明で無傷の卵殻を指しています。(B) キチナーゼで10分間処理した卵子は消化され、胚の周囲には見えなくなりました。矢印は、卵殻から放出された三重の胚を指しています。青いボックスは、互いに結合したままのセルのグループを囲んでいます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
>試薬
LeibovitzのL-15ミディアム(1x)リキッド	インビトゲン	11415から064
ウシ胎児血清	インビトゲン	16140-063
ペニシリン-ストレプトマイシン	シグマ	4333-100ミリリットル
キチナーゼ Streptomyces Griseus	シグマ	C6137-25UN
ピーナッツレクチン	シグマ	L0881 - 10MG
装備
101-1000 μl ブルー目盛りピペットチップ	USAセンティフィック	〒1111-2821
10 ml 滅菌ピペット 個包装	USAセンティフィック	〒1071-0810
人間工学に基づいた可変容量(100-1000 μl)チップエジェクター付きピペッター	VWRインターナショナル株式会社	89079から974
ポータブルピペットエイド、ドラモンド	VWRインターナショナル株式会社	53498から103
トランスファープラスチックピペット滅菌	VWRインターナショナル株式会社	14670-114
15 ml コニカルチューブ	USAセンティフィック	1475-1611
滅菌18ゲージ針	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	305196
滅菌10ml注射器	ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー	305482
プラスチックシリンジフィルターコーニング0,20μmの細孔サイズ	コーニング	431224
アクロディック25mmシリンジフィルターW / 5μmバーサポーメンブレン	VWRインターナショナル株式会社	28144-095
60x15 mm ペトリ皿滅菌	VWRインターナショナル株式会社	82050-548
100x15 mm ペトリ皿滅菌	VWRインターナショナル株式会社	82050-912
12 mm直径ガラスカバースリップ	VWRインターナショナル株式会社	48300-560
クリアセルカルチャープレート 24ウェルフラットボトム 蓋付き	トーマス・サイエンティフィック	6902A09
Dumont #5- 細い鉗子	ファインサイエンスツール	11254から20
遠心分離機5702	エッペンドルフ	22629883
層流フード
x10対物レンズ付き倒立顕微鏡
周囲空気加湿インキュベーター