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次のプロトコルは、Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015)からの抜粋です。
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アッセイ前日に行う手順
- L4ステージの線虫を、OP50 E. coliの芝生を播種した新鮮な線虫増殖培地(NGM)プレートにピッキングし、20°C O / Nで培養します。各アッセイ条件には10匹の線虫が必要です。ワームのO / N損失を可能にするために、過剰なワームを選択します。
- 初日の成虫である動物のみを分析し、多くの突然変異体は野生型よりも遅い速度で成長します。発達遅延のある株の摘み取りのタイミングを調整して、試験されたすべての動物が初日の成獣になるようにします。
- アッセイ当日に実施する手順
- アッセイの準備:
- 標準的な未シードの60 x 15 mm NGMプレートでアッセイを実施します。使用するすべてのプレートを蓋を外して、37°Cで2時間乾燥させます。各実験的試験では、4つの乾燥NGMプレートを使用します。これらは、0 mMおよび400 mMのエタノールアッセイプレートとそれに付随する順化プレートです><。
注:ここでは、NGMプレートの使用が重要です。プレートの組成の違い、特にそれらの浸透圧は、行動に対するエタノールの用量反応に強く影響を及ぼす可能性があり、これは、少なくとも部分的には、動物によって蓄積されるエタノールの量の変化によるものである。NGM寒天は160mOsmです。
- 乾燥後、アッセイで使用するシードされていないNGMプレートをそれぞれ秤量し、その重量をメモします。空のプレートの重量に基づいて、プレート内のメディアの量を決定します。寒天の重量から体積への変換を概算するには、メディアの重量が等量の水と同じであると仮定します。
注:最も一貫した結果は、元の 10 mL の容量が 8.3 〜 8.9 mL の乾燥後容量を持つほど十分に脱水された NGM 培地で発見されました。2時間の乾燥時間に代わる方法は、インキュベーターの違いを考慮して、プレートがこの容量範囲に達するまで乾燥させることです。
- 4つの銅リング(内径1.6 cm)を各プレートの表面に溶かして、さまざまな遺伝子型または治療グループのワームの囲いとして機能します。各リングを鉗子でつかみ、炎(ブンゼンバーナーからの強い炎が効果的です)で約3秒間加熱します。リングを鉗子で保持したまま、リングをすぐにプレートに置き、「スキップ」しないようにします。
- リングのいくつかのポイントで鉗子をそっと押し下げて、リングが寒天の表面に対して平らになっていることを確認します。リングを置くときは、さらに3つのリング用のスペースを空けるように注意してください。
- 追加の 3 つの銅リングをプレートの表面に溶かし、4 つすべてがカメラの視野に入るように、できるだけ近くに配置するようにします。
注:寒天と良好なシールを作ることは、アッセイ中に線虫をリング内に保持するために不可欠です。プレート上を飛び回るリングは、寒天と正しく密封される可能性が低く、寒天を傷つける可能性があります。これにより、ワームが穴を掘り、ワームの視覚化が妨げられる可能性があります。
- 各アッセイプレートについて、付属の「順応」プレートを準備し、これは乾燥させて播種せず、エタノールを受け取らないようにする必要があります。これらのプレートに4つの銅リングを配置します。
- 各リングの隣のプレートの底部に、リングで使用するワーム株のラベルを付け、リング自体の視野に書き込まないように注意してください。アッセイプレート上のラベルを付属の順化プレートと一致させます。
- 最終濃度が0 mMまたは400 mMエタノール(重量対体積)になるように、各アッセイプレートに添加する100%エタノールの量を計算します。各実験(n = 1)には、1つの0 mMと1つの400 mMエタノールプレートがあります。順化プレートはエタノールを受け取りません。エタノールを加え、プレートの表面にピペッティングします。ラボ用フィルムを使用してプレートをシールし、ベンチトップで2時間平衡化させます。
- 1.5時間が経過したら、アッセイの順化ステップ(ステップ2.2)を開始します。
- ロコモーションアッセイの実施:アッセイプレート
- 各実験グループの10個のワームを、順化プレート上の銅リングの中心に慎重に移します。この時点で寒天に見える食べ物は、ワームピックでそっとこすり落として取り除きます。実験グループをプレートに配置する順序を、同じ株が試行間で同じ順序でプレートに配置されないように、実験試行間で変更します。
注:目標は、順化プレート上の食物がアッセイプレートに移されると、線虫が食物の周りに集まり、運動に対する薬物の影響が不明瞭になるため、最小限の食物で動物をプレートに移すことです。
- ピックで寒天の表面を壊さないように注意してください、これによりワームが穴を掘り、アッセイが中断されます。ワームをRTで30分間インキュベートします。
- 各プレートの開始間に適切な間隔があることを確認してください。経験豊富な実験者は、40匹の動物を1.5分<で4リングの動物を動かすことができますが、最大2分までの間隔でも許容されます。標準アッセイでは、0 mMおよび400 mMエタノールの両方について、10〜12分および30〜32分の露光で動画を記録します。
- 0 mM露光用の順化プレートと400 mM露光用の順化プレートを約2分30秒間隔で開始し、2番目の動画を開始する前に最初の動画ファイルを保存できるようにします。
- 30分間の順応期間後、線虫を順化プレートからアッセイプレートに移します。ワームをアッセイプレート(0 mMまたは400 mMエタノール)に、順化プレートに加えたのと同じ順序で移し、各プレートの完了間のタイミングを追跡します。プレートを実験用フィルムでシールして、気化によるエタノールの損失を最小限に抑えます。
- 薄いエッジの平らなワームピックですくい取る動作を使用して、平らなピックの上にワームを収集します。バクテリアを使用せずに、シードされていない順応プレートからアッセイプレートへのワームの移動を実行します。これは、ワームをピックに接着するのに役立つため、ワームの転送に一般的に使用されます。
注:プレート上の最初の線虫は、プレートに追加された最後の線虫よりも長くエタノールにさらされ、それより早い時点が時間依存的な影響を示す可能性があるため、このステップで動物が移動する速度は非常に重要です。これが、実験の反復でプレート上に最初に配置される菌株を回転させる主な理由です。
- ロコモーションアッセイの実行:撮影
- 視野内の4つのリングすべて(約42x42 mm2平方)を同時にイメージングできる顕微鏡とカメラの組み合わせ、たとえば、0.5倍の顕微鏡対物レンズ、0.8倍の倍率、2048x2048 7.4 μmピクセルCCDを備えたカメラ
などを使用します。
- 視野全体に均一な照明を使用することで、強度の閾値ステップでの物体認識に役立ちます。3インチx3インチのバックライトがうまく機能します。
- メディア側を上にして(蓋を下にして)配置したプレート上の線虫を画像化することで、従来の顕微鏡透過光源と比較してバックライトを使用するとコントラストが失われます。
- 移動するワームのタイムラプス動画を撮影するための画像解析ソフトウェアを準備します。1秒ごとに12ビットグレースケールの画像を2分(120フレーム)の動画として撮影するように設定します。十分な画像解像度を維持しながら出力ファイルのサイズを縮小するには、2x2 ビニング モードを使用して 1024x1024 ピクセルの画像をキャプチャします。
- 動画を録画します。最初のプレート(0 mM エタノール)の 120 フレームの動画を、最後の線虫をそのプレートに置いてから 10 分後に録画を開始します。動画ファイルを保存します。
- 2 枚目のプレート(400 mM エタノール)を記録します。最後のワームを最初のプレート(0 mMエタノール)に配置してから30分後から両方のプレートでこのプロセスを繰り返し、各曝露の30〜32分の時点をキャプチャします><。
注:各キャプチャセッションの後、画像を保存するのに十分な時間を確保してください files次に分析するプレートの記録を開始する前に。
- アーカイブされた映画の将来性を確保し、これらの映画をImageJなどの他のパブリックドメインのオープンソースイメージングソフトウェアプログラムで開いて分析できるようにするには、各映画のコピーを8ビット256グレースケールTIFFファイルに変換します。
注:ここで説明する画像解析ソフトウェアは、独自のファイル形式を使用しています。