新規水槽潜水アッセイ:ゼブラフィッシュの自然ストレス応答を研究する方法

要約

出典:Chin J.S.R., et al. ゼブラフィッシュの生来ストレスを研究するための行動的アプローチ。J. Vis. Exp. (2019年)

この記事では、ゼブラフィッシュのストレスを評価するための行動方法について説明しています。ストレスに反応して、ゼブラフィッシュはストレスが取り除かれるまで水槽の底で泳ぐ傾向があります。サンプルプロトコルは、アッセイを実施するための段階的な方法を記載しています。

プロトコル

1. 新しいタンクテストのセットアップ

1. フィッシュシステムの水があらかじめ充填された250mLのビーカーと、少なくとも2つの保持タンクを準備します。
2. 試験当日の朝、各実験条件(対照群および実験成魚)に使用する試験成魚のゼブラフィッシュを少なくとも10匹、魚類施設から飼育水槽に移し、行動室に移し、少なくとも1時間順応させる
   手記：実験の前に検出力分析を行う必要がありますが、私たちの手では、通常、n = 10で統計的有意性を検出するのに十分です。さらに、保持タンクには、水1リットルあたり5人以下の個体を含める必要があります。ゼブラフィッシュの成魚は新しい水槽から30分以内に慣れることが示されているため、1時間の順応で十分です。また、行動リズムは概日リズムの影響を受けるため、異なる日に行われる実験の反復は同じ時間内に実行する必要があります。通常、午前11:00から午後6:00の間にすべての実験を行います。
3. 動物の状態または遺伝子型が実験者に対して盲目になるように、水槽にラベルを付けます。
   手記：実験は、文字または数字のシステムを使用してタンクにラベルを付けることで、実験者に対して簡単に盲検化できます(つまり、1つのタンクには「A」、別のタンクには「B」などとラベルが付けられます)。実験に関与していない当事者は、このようなシステムでタンクにラベルを付け、事後分析が完了するまで実験者から身元を隠します。
4. ネットを使用して、手順1.1から事前に充填されたビーカーに1人の成虫をそっと置きます。成魚がビーカーに10分間順応するのを待ちます.
   手記：性別固有の違いを探すために事後分析が重要になる可能性があるため、成人の性別を記録します。
5. ビーカーに順応した後、ビーカーから水と成魚を穏やかに注ぎ出して、魚を新しいタンク(以下に詳細を設定)に導入します><。 手記：このセクションのステップでは、新規タンクアッセイの設定について説明します。最終製品の図を図1Bに示します。
   1. 新規タンクをテーブルの中央に置きます。
   2. 赤外線ライトをタンクの後ろに配置し、白いアクリルシートまたはディフューザースクリーンをタンクとLED光源の間に置きます。
   3. LEDからの光が最大限に広がり、光の強度が新しいタンクを照らすのに十分になるようにディフューザーを配置します。ボードが光源に近づくほど、ライトは明るくなりますが、拡散は少なくなります。対照的に、ディフューザーボードを光源から離して配置すると、光の強度は低下しますが、光はより広がります。
   4. 新規水槽の約4分の3を魚系の水で満たします.
      手記：水道水の逆浸透膜を使用してシステム水を生成し、導電率が900±100μSに等しく、pHが中性(7.2)、温度が27±1°Cになるように投与します。
   5. カメラをカメラスタンドに取り付け、カメラをコンピューターに接続します。ビデオ集録ソフトウェアを開き、カメラをタンクの正面に向けるように調整し、新しいタンク全体が見えること、およびビデオに隠れた領域がないことを確認します。カメラを通して観察するときに、タンク全体に十分かつ均一な照明があるように、タンクと赤外線ライトを調整します。
      手記：実験に進む前に、魚のビデオをキャプチャして追跡する試運転を行うと便利なことがよくあります。これにより、動作の実験に十分なセットアップが保証されます。
6. 成魚を新規水槽に導入した後、カメラ録画を開始し、魚へのさらなる苦痛を防ぐためにセットアップから離れます。
7. 録音が終了したら、新しいタンクから個体を取り出し、新しい保持タンクに入れます。
   手記：ステップ1.2のものとは異なる保持タンクを使用して、同じ個人でテストが繰り返されるのを防ぐ必要があります。

結果

図 1.新しいタンクのセットアップの図。(A)タンクの記録側から見た1.8L台形新規タンクの寸法。(B)赤外線ライト、カメラ、および人間の干渉を最小限に抑えるために使用されるバリアの位置を含むセットアップの図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カメラ			私たちは、エドモンド・オプティクスのレンズ付きポイントグレーグラスホッパー3USBカメラを使用しています。
赤外線フィルター	エドモンド・オプティクス
ビデオアクイジションプログラム			VirtualdubやFlyCaptureなどのプログラムは、取得フレームレートを設定できるため、使用してください。
赤外線LEDライト
アッセイタンク	アクアニアリング	品番 ZT180	サイズ:M3 1.8リットル
スタンドとクランプ、またはカメラ用の標準三脚
250mLビーカー
追跡ソフトウェア			私たちはノルダス情報技術からEthovision XT 13を使用しています