胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ

サマリー

別の遺伝子による補償がある場合は、遺伝子の機能は、機能喪失実験で隠されることができる。ゼブラフィッシュのモデルは、生きている胚ではそのような機能的な冗長性を明らかにするために、比較的高スループットの手段を提供します。

要約

胚発生時の遺伝子の機能は通常、マウスにおける標的特異的変異（ノックアウト）するなどして、機能喪失実験によって定義されています。ゼブラフィッシュのモデルでは、効果的な逆遺伝学的手法は、遺伝子特異的アンチセンスモルフォのマイクロインジェクションを使用して開発されました。モルフォは、胚発生（ノックダウン）の間に数日間のための翻訳を阻害するか、選択的スプライシングによって一過性に特異的塩基対形成とブロックの遺伝子の機能を介してmRNAをターゲットとしています。しかし、マウスやゼブラフィッシュなどの脊椎動物では、いくつかの遺伝子の機能は、損失を補償する他の遺伝子の存在により、これらのアプローチによって隠されることができる。これは、同じ発展途上の組織で共発現している姉妹の遺伝子を含む遺伝子ファミリーのために特に当てはまります。ゼブラフィッシュでは、機能的な補償は、その同時に両遺伝子のターゲットのノックダウンモルフォの同時注入によって、比較的高スループットな方法でテストすることができます。同様に、モルフォを使用して、任意の2つの遺伝子間の遺伝的相互作用は、サブスレッショルドレベルで一緒に両遺伝子のノックダウンによって実証することができます。例えば、モルフォは、どちらも個々のノックダウンは、表現型を生成するように滴定することができます。 、これらの条件下で、両方モルフォの同時注入が表現型を引き起こす場合、遺伝的相互作用が示されています。ここでは2つの関連GATA転写因子のコンテキスト内で機能的な冗長性を表示する方法を示します。 GATA因子は、心臓前駆細胞の仕様のために不可欠ですが、これはのみGata5とGata6両方の損失が明らかにされる。我々は、マイクロインジェクション実験を行うモルフォの検証、および心臓発生のための補償表現型を評価する方法を示します。

プロトコル

ここで我々の目標は、心筋前駆細胞の仕様のための2つの転写因子の機能的冗長性をテストすることです。要因は2つの関連遺伝子gata5とgata6によってコードされていると我々は、彼らの相対的な機能^1を理解するためにゼブラフィッシュモデルを使用しています。当社の戦略は、モルフォ^2を用いて遺伝子の機能をブロックすることです。我々は、1つまたは受精卵に他の遺伝子に対するモルフォを注入し、両方のモルフォと同時に注入された卵から得られた胚を胚の表現型を比較します。表現型の評価を簡素化するために、我々は心筋細胞にGFPを発現する遺伝子を運ぶ魚由来の卵を使用してください。

ステップ1。マイクロインジェクションのために準備。

魚の繁殖ペアの設定）

注射前に夜、独身男性と独身女性成魚（生後3〜18ヶ月）は翌朝まで分周器で区切られたブリーダーのタンクにペアで配置されます。我々は関係なく、卵は産卵数を維持するために、使用されるかどうかの、一般的に魚の10〜20のペアを設定し、これらは週に1回交配されています。それは差別化心筋細胞を識別するための単純な読み出しを提供しているため、EGFP：この実験のために我々はcmlc2のために、トランスジェニックをレポーター株を使用しています。翌朝は、一度のライトがオンにされ、水が変更され、分周器は、魚のペアが卵を交尾して生産できるようにタンクから抜き出されます。卵の生産は、魚に応じて、監視することができる、とすぐに開始することができる、または時間以上の期間の後に。一般的に、途切れない交配の約20分後、卵はピペットやストレーナーを用いて収集され、システムの水を含む100mMペトリ皿に注ぎ。胚は、1から4細胞期の間に注入されることを保証するために、卵の生産を監視することが重要です。一度に複数のペアを放出することによって、それは卵の生産をずらすと、それによって初期の発達段階で注入することができる卵の量を最大限に活用することが可能です。魚の良いペアが200以上の胚を生成することがあります、と彼らは4細胞期を越えて発展する前に、単一の研究者が迅速に十分にそれらを注入することができないだろうので、それは、同時に卵の数千人を集めるために実用的な意味がありません。魚が光サイクルで繁殖するために刺激されているので、これは早期に開始する必要がある、と卵は、通常正午の後に得られていない実験です。

B）針の準備

1. ので、= 60、ベロシティ= 60、およびTime = 250プル我々は、フィラメントが含まれていないオープンコアの針を使用して、ヒート= 626：次の条件を使用して2本の針を生成するためにマイクロピペットプラーと3.5"ガラス毛細管を使用してください我々は、吸引でそれらをフロントフィル。
2. 各針の先端は、静かにきれいなかみそりの刃やピンセットを使用して壊れ、そしてその後EG - 4マイクログラインダーを使用して約20秒間、角度30度傾斜がついています。これは、先端を鋭くして、絨毛膜を介して注入する場合に重要です。
3. それは約15ミクロン（1-2 NLの注入量を校正することができるように、格子顕微鏡の接眼レンズを使用して4単位としてキャリブレーション）の一貫性のある針の直径が先端のサイズを取得することが重要です。
4. 針は、事前に用意して安全な場所に安全に格納され、それぞれを個別に（詳細については、セクションDを参照）一貫性の注入量を確保するための注射を開始する直前に較正されてする必要があります。もし幸運であれば、実験全体に対して単一の針を使用することができるかもしれません。しかし、針は簡単に実験の途中で中断することができ、新しい針を引っ張ってその時間を使用する必要はありません。

C）注入プレートを作る

1. 電子レンジで煮沸することにより、システムの水で2％アガロース溶液100mlを準備。
2. タッチにクール、と100ミリメートルペトリ皿の反転蓋に12ミリリットル程度注ぐ。
3. 蓋の両側に、約45度の角度で傾斜し、2顕微鏡のスライドを挿入します。アガロースが固化した後、静かに蓋から離れて2つのスライドを引き出します。
4. これは、胚が置かれ、その後注入される谷を作成します。複数のプレートは、事前に準備しておくことができる。これらは、オリジナルのプレートの底部を加え、パラフィルムで密封、70％エタノールの層を追加した後、4 ° Cで無期限に保存することができます。使用前によく洗うことを忘れないでください。

D）マイクロインジェクションステーションおよび針のキャリブレーション

1. 圧縮された窒素源とPLI - 100マイクロインジェクターをオンにします。インジェクタは18 PSIの一定の流れの圧力のために調整する必要があります。
2. 針を挿入する前に、マイクロマニピュレータの動きの広い範囲を可能にするために適切な位置にあることを保証する、および挿入された針は、テーブルを叩いたりしないこと。のいずれかを挿入する針は、タイトなシールがあるか確認しながらマイクロマニピュレータに（セクションCを参照）事前に準備。針を壊さないように注意してください。
3. それはキャリブレーションに進む前に目詰まりがないかを確認するために顕微鏡下で針先を観察。
4. パラフィルムの小片上に注射液またはのddH ₂ Oの低下（2-3μl）を配置し、[塗りつぶし]ボタンを使用して針にそれを引いて、約1.5μlを埋める。あなたが完全に溶液中で針の先端を持っている、とし、気泡で図面を避けるために、顕微鏡で液体吸引を守っていることを確認してください。
5. マイクロメートルのグリッド上にミネラルオイルを一滴を置きます。
6. 経験的にドロップのサイズは直径約1​​.5ミクロンであることを保証するために注射の時間を調整します。これは約1.8 NLの注入量をお届けします。実際の音量はお好みに調整するが、実用的な意味でそれは正確に1 NL、および胚下のボリュームを2 NLの上にボリュームを容認することはできませんキャリブレーションすることは困難であることができる。かかわらずボリュームサイズのあなたはそれのコントロールを含むすべての注射のための同じを維持、選択、および注入モルホリノの量を滴定するために、溶液濃度を（むしろ注入量よりも）を調整します。
7. 針の先端のサイズが異なる場合がありますので、再キャリブレーションは、針が交換されるたびに必要です。

ステップ2。二つの異なる遺伝子を標的とモルフォの検証

モルフォは、それによってタンパク質の合成または適切なmRNAプロセシングをブロックし、ターゲットmRNAの翻訳開始部位またはスプライス部位を標的にするよう設計されています。初めての遺伝子を分析するとき、我々は、特定のノックダウンを示し、それらが同じ表現型を生成するかどうかをテストするためにモルフォの両方のタイプを使用してください。スプライス-ブロッカーの利点は、標的遺伝子に対する抗体が利用できない場合に特に有用であるRT - PCRにより正常な転写産物のノックダウンを確認できることです。 '; gata5スプライス部位MOシーケンス：5' - TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA - 3'、5' - AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT - 3：私たちは、一貫性のある心臓の表現型がモルフォ（gata5 5'UTR MOのシーケンスを使用してgata5とgata6遺伝子にどのように実現されるかを説明しますgata6 5 'UTR MOのシーケンス：5' - AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA - 3'）。

1. モルフォは、遺伝子のツール、LLC（フィロマス、OR）から取得されます。遺伝子のツールでは、彼らのサポートスタッフに言わせれば、あなたがターゲットへの最適なシーケンスを選択することになります。あなただけの彼らにアクセッション番号を送信する必要がある、と彼らがアドバイスします。しかし、モルホリノは、活動を検証するために準備する必要がある理由である、動作することを保証するものではありません。モルホリノがOpenBiosystemsから利用できるかどうかもチェックすることができます。遺伝子のツールは、OpenBiosystemsに合成されたモルフォの株式を提供します。それがうまくいく保証は再びないが、彼らは新たな目標をテストするための負担するコストを助けるかもしれない、低コストで少量を販売しています。トランスクリプトームと照らし合わせてモルホリノをBLASTしてください。我々はUCSCゼブラフィッシュゲノムブラウザ（genome.ucsc.edu）でBLATの機能を使用してください。モルホリノが文献で（厳密に）検証されている場合はもちろん、、それはあなたがその同じシーケンスを購入することをお勧めします。
2. モルホリノを1mMの最終濃度に無菌のddH ₂ 0に溶解し、室温で保存されます。低温は、時には集約し、沈殿にそれらを引き起こす可能性が何らかの理由として、モルホリノソリューションを冷凍はしないでください。モルフォは、プロテアーゼまたはヌクレアーゼに大文字小文字を区別しませんので、限り、あなたは追加の水は無菌であるため、それらは室温で非常に安全なはずです。
3. 注入する前に、65℃モルホリノをインキュベート℃で5分間、それを保証するためのCが完全に溶解し、室温まで冷却することができますされています。サンプルを氷上に置いてはいけません。注射するまで室温でモル​​ホリノしてください。
4. モルホリノを滴定するために、我々は典型的には1 mMの、0.5mMの、0.25 mMの、と0.125mMの使用濃度を得るためのddH ₂ 0のストック濃度の希釈系列を用意。注入量の1.8 NLを使用して、シーケンスに応じて、これは約20ng、10ng、5ng、および注入あたりモルホリノの2.5ngを表します。各モルホリノの寛容性と有効性が変化すると予測することができないので、これは、単なる出発点です。ほとんどのモルフォは20 ngの上にあまり許容されませんが、一部はうまくは1ng以下の用量で効果的です。我々のアプローチは、少なくとも表現型"プラトー"の濃度を定義することです。言い換えると、定義された表現型は2.5 ngを使って見たが、5 ngの以上で任意の量を使用して似ているされていない場合、我々は、しきい値量を5 ngを選ぶだろう。もちろん、それはあなたが"国境に"ではなく、右ではなく、再現性のしきい値を超えて作業していることを保証するために、2.5 ngのと5.0 ngの間で次の滴定に便利かもしれません。
5. 接続されているとキャリブレーション針を埋める最小作用濃度（最も希釈）モルホリノ液で（上記参照）。それは単に材料を無駄にするので、針を過剰充填は避けてください。あなたが唯一の1μlを記入した場合、500注射のための十分な解決策があります。
6. 使い捨てピペットを使用して、マイクロインジェクションプレートの谷に受精した1細胞胚を移す。胚はインジェクションの谷の底に落ちることを保証するために余分な水分を取り除きます。彼らは浮くのではなく、アガロースのベッドに準拠してはいけません。
7. マニピュレータは絨毛膜を通って注入するための卵黄に針先を下ることができるように注入プレートを置きます。個々の胚を配置するには、注射針の先端が正しい位置に胚をプッシュまたはプルするように注入プレートを操作する。針先やダメージの胚を壊さないように注意してください！これにはいくつかの練習がかかりますが、ルールとしては、むしろ速やかにかつクリーンに出、注射後にして胚に注射針を移動し、単純にマイクロマニピュレーターを使用。胚は（あなたの右手で注入する場合の手を離れて）あなたのフリーハンドを使ってプレートを移動することによって、注射の位置に取り込まれます。新しい学習者の場合、それは注入溶液を視覚化するための0.25％フェノールレッドを含有する溶液を使って練習するのに便利です。自信はまた、マイクロスフェア（Molecular Probes社、F - 8794）蛍光標識を含む溶液を注入することによって取得され、そのソリューションを確認するために、むしろ間絨毛膜空間ではなく、胚に注入した。しかし、実際の数ラウンド後に、これらの助剤は典型的にはもはや必要ありません。それはちょうど針が詰まって注入されているボリュームが適切な表示されていることをされていないことを確認するために、時々空気中に注入することをお勧めします。
8. 注入された胚は、システムの水と100ミリメートルペトリ皿に戻されて、28.5Cで培養されています。最低作用濃度の注入後、残りの解を追放し、モルホリノの次に高い使用濃度は、針を埋めるために使用することができます。モルホリノの各濃度について、この手順を繰り返します。それは水を使用して針を洗浄することは可能ですが、明確なモルホリノをテストするとき、我々は、針を変更して再調整することを好む。胚の特定のバッチ処理が健全かつ正常であったかどうかを確認するためにuninjected胚のコホートを保管してください。

ステップ3。個別のしきい値の用量でモルフォの共同注入

上記実施滴定の目標は、各モルホリノのしきい値の線量を定義することでした。標的遺伝子が本質的な機能を持っている場合最良のシナリオでは、morphantsの本質的に100％は、定義された表現型が表示されます。ただし、誤注入のアーチファクトに起因するいくつかの変動を期待することができます。練習すれば、これは10％を超えてはならない。胚（uninjectedコントロールを含む）のいくつかのバッチは、実験が割り引かする必要があるかもしれない、その場合には、よく耐えられないかもしれません。個々の胚は、多かれ少なかれ、ノックダウンに耐性となる可能性があるので一方、生物学的変動は、もあります。最後に、いくつかのモルフォは、単に堅牢な（浸透）ノックダウンを達成するの​​に十分な効率的ではありません。表現型が胚の割合が低いに生成されたが、再現可能である場合、それは明確なモルホリノをテストする価値があるかもしれない。この次の実験の目的は、両遺伝子を同時にターゲットにしているときに、まったく新しい表現型が見られるかどうかを判断することです。我々は、単にmorphant表現型を有する胚の割合が増加するためではなく、個々の遺伝子のいずれかをテストする際のしきい値レベル以上ない、と思われている明確な表現型の世代を探しされていません。

1. 定義された表現型を生成した個々のモルホリノのしきい値の濃度で、以前にテストしたモルフォの組み合わせの混合物を準備します。例えば、各遺伝子のしきい値が5 ngのだった場合、それぞれ5 ngの+ 5 ngの（10 ngの合計）を格納する作業溶液を調製。胚は、20 ngのトータルモルホリノよりもはるかに許容されないことがありますので、それは効率的にそれぞれの遺伝子を標的とするのに十分であるそれぞれの最小​​量を使用するために、前の実験に基づいて、重要です。
2. コントロールは組み合わせで使用されたのと同じ濃度で各モルホリノ単独で注入された胚のセットを含める必要があります。注射液のボリュームが（例えば1.8 NL）を一定に保つ必要があります。レポーター株を用いての大きな利点は、繰り返し、いつでも表現型（例えば心筋細胞の分化）を評価し、できることです。胚は、in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現のために評価する場合は、ステージをマッチさせた胚とコントロールは様々な時代ポスト噴射に固定することができます。私たちの実験では、我々は約24 HPFで、心筋細胞の分化の代用として、GFPの発現を評価しようとしている。

ステップ4。 E表現型の評価

1. これらは、残りのmorphantsの生存能力を損なうことができるので注入胚は、単に注射の後、監視、および日中数回、任意の死者や死にかけている胚を削除する必要があります。レポーター遺伝子の発現を評価するために、胚を蛍光容量を装備解剖顕微鏡を用いて検討している。我々は1Xまたは1.6X目的と0.75xから11.25xの倍率の範囲で、ニコンSMZ1500顕微鏡を使用してください。蛍光フィルターを使用する場合、光強度を最大化するために完全にオープンな設定に横隔膜を開くようにしてください。また、レポーター遺伝子（GFP、RFP、等）に応じて、適切なフィルタを使用してください。
2. 胚は、通常、tricaineメタンの4mg/ml株式のシステムの水1 / 20希釈を使用して鎮静されています。株式は、- 20Cで凍結保存されています。また、胚を20倍tricaineの株式を用いて安楽死することができます。彼らは絨毛膜に残っている場合でも、胚は通常、スクリーニングすることができる。しかし、それらは撮影される場合は特に、それは鋭いピンセットを使用してchorionsを削除することをお勧めします。胚はtricaineの溶液中でうつ病のスライドに配置すること、以上3％メチルセルロースの小滴に入れ撮影のためにそれらを固定するために後に見ることができます。
3. シングルmorphantsに比べモルフォの組み合わせを注入、それらの胚の表現型を観察。ここでは、原始心管におけるGFPの発現のパターンを探しています。このレポーター株のGFPで心臓の仕様と心臓の管の形態形成の詳細な分析を可能にするcmlc2プロモーターを介して心筋細胞にのみ発現される。

代表的な結果

しきい値レベルを注入するときにかなりの生物学的変動^3,4があります^が私たちの実験では、両方gata5とgata6シングルmorphantsは、再現可能な心臓の表現型を示す。例えば、gata5 morphantsのほとんどは、二つの領域に位置するGFPの発現で、二分心を生成します。心臓前駆細胞は、心臓の管の形成時に正中線で融合する正しく移行できないために発生します。しかし、gata5 morphantsのいくつかは、欠陥のある心臓のチューブを生成するか、および少数（5％）でGFP +細胞の量が大幅に低下を起こすことがあります。我々は、これは生物学的変動を反映すると信じて、しかしまたモルフォは、"ヌル"突然変異と同等ではないという事実が原因である可能性があります。

同様に、gata6 morphantsはすべての心臓の表現型を示しているが、小規模な二分数加熱、およびuninjectedコントロール胚に比べて乱れの形態学的な心を含む表現型の範囲があります。心臓の形成が動的なプロセスであると、少なくとも心の表現型の一部は胚形態形成の欠陥から間接的に起因するかもしれないので、この変動は、心臓の形態形成の表現型は珍しいことではありません。しかし、重要なのは、gata5とgata6両方morphantsのための心臓の形態形成の欠陥の範囲は、一貫性と再現性、および大部分の胚は、実質的なGFP +心筋細胞を生成する。

gata5とgata6シングルmorphantsとは対照的に、両方の要因が枯渇胚では、心筋細胞の消失と一致するGFPの発現の完全な損失を示す。このように、gata5とgata6それぞれが心臓の形態形成のための非冗長機能を持っているが、二つの遺伝子は、分化した心筋細胞を生成するための要件で機能的に冗長です。私たちの以前の研究では、心筋細胞の仕様³の要件を示唆し、またnkx2.5を含む初期の心筋細胞マーカーの消失を示した。

ディスカッション

実験は、ここで説明では、我々は2つ​​のモルフォ、単独で表現型の異なる範囲を生成、そのうち、それぞれを組み合わせて、それらが一緒に共同注入した全く異なる表現型を発見した。もちろん、我々は最初の場所でこの実験を行うための正当化を必要としていました。我々は2つ​​の遺伝子が、この場合心臓の仕様で、以前の関数のためにお互いを補うかもしれないことを疑った。遺伝子が高度に関連している（と同じDNA配列に結合することができる）と胚⁵でパターンがオーバーラップで表現されているためです。さらに、 ショウジョウバエの遺伝学的実験GATA転写因子は、心臓の仕様⁶で必要とされるべきであることが示された。

しかし、この戦略は、遺伝的相互作用の機能的な冗長性あるいはより一般的にテストするために使用されている他の状況があります。最初に、一方または両方の遺伝子のノックダウンは明らかな表現型を生成しないことがあります。この場合、それぞれの遺伝子に対して定義された閾値レベルは存在しない、および使用するためにモルフォリノの量は、経験的に定義され、それらが胚...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
魚のブリーダータンクと仕切り	水生生物の生息地魚
網水	生生物の生息地
システム水			60mgインスタントオーシャン”リットルあたりdH2O
100mmペトリ皿	BDバイオサイエンス	351029
マイクロピペット針引きサ	ッターインストゥルメント株式会社	P-97 フレーミング/ブラウン
3.5インチ ガラス毛細血管	ドラモンドサイエンティフィック	3-000-203-G/X
カミソリ刃	ペルソナ メディカルケア	94-120-71
マイクログラインダー	成重インターナショナル	EG-4
グリッド顕微鏡接眼レンズ	プレミア	MF-02
マイクロメーター	WARD's Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Scale	メトラー・トレド	AB54-S/FACT
ディスポーザブル計量皿	Fisher Scientific	2-202-B
従来型マイクロ波	GE Healthcare
三角フラスコ	コーニング	4980
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-552
メスシリンダー	フィッシャーサイエンティフィック	08-572-6D
自動ピペットマン	BrandTech	2026333
70% エタノール洗浄液	タール	801VWR
N2 タンク	テックエア
マイクロインジェクター	ハーバード装置	PLI-100
マイクロマニピュレーター	マイクロインスツルメン	ツ株式会社
解剖顕微鏡	ニコンインスツルメンツ	SMZ1500
パラフィルム	アメリカンナショナル 缶	PM-992
鉱物油	シグマ・アルドリッチ	M5904
キムワイプ	キンバリー・クラーク株式会社	34155
gata5 スプライスサイト morpholino	Genetools, LLC		5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'
gata5 ATGブロッカー	Genetools, LLC		5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'
gata6 Long Isoform ATG Blocker	Genetools, LLC		5'-AGCTGTTATCACCACCCAGGTCCATCCA-3'
使い捨てパスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィ	13-678-20B
トリカインメタンスルホン酸	アージェントラボ	MS-222
チセルロース	ICNバイオメディカル	155495
ヒートブロック	フィッシャーサイエンティフィック	11-718-4
鉗子	デュモン		サイズ55
マイクロスライド	VWR国際	48339-009