出典: Lombardo et. al., Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. J. Vis. Exp. (2015年)。
このビデオでは、乳がん細胞株からがん幹細胞を分離する方法を説明しています。これらのがん幹細胞を培養して初代マンモスフィアを作製し、自己複製の評価と球体形成効率の計算を行い、異なる播種密度間での比較を可能にします。
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方法論記事
初代マンモスフィアの作製:細胞の効力を決定する技術
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
1. ヒト乳がん細胞株からの初代マンモスフィアの生成
>注:無菌培養フードの下で次の手順を実行してください。
- 2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、100 U/ml ストレプトマイシンを添加した DMEM/F12 を含む Mammosphere 培地を調製します。使用直前に、20 ng/mlの組換えヒト上皮成長因子(EGF;Sigma)、10 ng/ml 組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF;R&D Systems)と1x B27サプリメント。
- 付着性MCF-7またはMDA-MB-231細胞(または任意の乳がん細胞株、70〜80%のコンフルエンス)を含むフラスコから培地を吸引し、1x PBSで2回洗浄し、細胞をトリプシンします。
- 細胞を200 x gで室温で5分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞を1〜5 mLのマンモスフィア培地に再懸濁します。ピペットで上下させ、必要に応じて40 μmセルストレーナーキャップフィルターを使用してシングルセル懸濁液を取得します。血球計算盤を使用して、単一細胞懸濁液が形成されていることを確認します(形成されていない場合は、25 Gの針を使用して細胞懸濁液を最大3回シリンジします)。
- 必要に応じて、抗CD24-フィコエリトリン(PE)および抗CD44-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)モノクローナル抗体9を使用して、FACSを介してCD44+CD24-細胞サブセットを単離します。あるいは、製造元の指示に従って、抗CD44および抗CD24-ビオチンを組み合わせたマイクロビーズを備えた磁気活性化セルソーティング(MACS)システムを使用して、そのような集団を単離します。LSカラムを使用してポジティブセレクションを行い、LDカラムを使用してネガティブセレクションを行い、フローサイトメトリーによってすべての単離細胞の表現型を確認します。
- トリパンブルーを使用してmlあたりの生細胞数を計算します.
手記：細胞生存率は、生存細胞の数を血球計算盤のグリッド内の細胞の総数で割った値として計算されます。トリパンブルーを取り込む細胞は生存不能と見なされます。以下の手順を用いて、生細胞の割合を正確に測定します。- PBS中のトリパンブルーの0.4%溶液を調製します。0.1 mLのトリパンブルーストック溶液を1 mLの細胞に加えます。血球計算盤をロードし、低倍率の顕微鏡ですぐに検査します。総細胞数と青色染色細胞の数をカウントします。生細胞 = [1.00 – (青色の細胞の数 ÷ 合計細胞の数)] × 100。
- 培養物1 mlあたりの生細胞数を計算するには、以下の式を使用します。希釈係数を補正することを忘れないでください.
生細胞数 × 104 × 1.1 = 細胞/mL培養
- 6ウェル超低接着プレートの各ウェルで、2 mLの完全マンモスフィア培地にあらかじめ決められた量の細胞を再懸濁します。播種密度は通常、ウェルあたり500〜4,000細胞/ cm2細胞です。オプションで、低接着性の24ウェルプレートを使用しながら、0.5 mLの培地に同じ密度で細胞を播種します
手記：対象細胞株ごとに播種密度と培養時間を最適化することをお勧めします。 - 超低付着性6ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2で5〜10日間(細胞株とマンモスフェアのサイズによって異なります)インキュベートします。特に最初の5日間の成長期には、プレートを乱さずにインキュベートします。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | ロンザ | CC-3151 | |
| 2 mM L-グルタミン | シグマ・アルドリッチ | G8540 | |
| 100 U/ml ペニシリン & ストレプトマイシン | シグマ・アルドリッチ | P4083 | |
| 20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子 (EGF) | シグマ・アルドリッチ | E9644 | |
| 20 ng/ml 組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF) | 研究開発体制 | 233-FB-025 | |
| 1x B27サプリメント | インビトゲン | 17504-044 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | サーモサイエンティフィック | 12399902 | |
| 0.5%トリプシン/0.2%EDTA | シグマ・アルドリッチ | 59418C | |
| ウシ胎児血清 | ファーストリンクUK | 02-00-850 | |
| トリパンブルー | シグマ・アルドリッチ | 93595 | |
| 低アタッチメント6ウェルプレート | コーニング | CLS3814 |
