標識PDX腫瘍細胞への形質導入:In vitroでの腫瘍細胞への蛍光マーカーを発現するレンチウイルスの導入

要約

出典:Hanna, C., et al.腫瘍の成長および転移研究のためのトレーサブルレポーターによる乳がん患者由来異種移植片のラベリング。J. Vis. Exp.(2016年)。

次のビデオでは、緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスとルシフェラーゼレポーターをin vitroで腫瘍細胞に導入するために使用される、標識(患者由来の異種移植片)PDX腫瘍細胞への形質導入の技術について説明しています。

プロトコル

1. PDX由来腫瘍細胞の形質導入

1. 解離した腫瘍細胞を300 g x 5分で遠心分離し、2 mLのマンモスフィア培地に再懸濁します。トリパンブルー排除を使用して生細胞をカウントします(消化した細胞を5 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、トリパンブルー排除を使用して生細胞と非生細胞の両方をカウントします。簡単に言うと、50 μlの細胞と50 μlのトリパンブルーを混合し、血球計算盤を使用してトリパンブルーを除く細胞をカウントします。
2. 8 μg/ml ポリブレン (培地 1 ml あたり 2 μl のストックポリブレン) を含む 10 ml のマンモスフィア培地を調製します。
3. 2 x 10⁵ の生存腫瘍細胞に必要な容量を決定します。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、ペレットをポリブレン含有培地2 mLに再懸濁します。プレート 2 x 10 ウェルあたり⁵ 個の生存腫瘍細胞を 6 ウェル超低接着組織培養プレートに入れます。.
   手記：これは、1つのレンチウイルスベクターによる形質導入に必要な細胞数です
   注意！レンチウイルス粒子およびレンチウイルス粒子とともに使用されるすべての消耗品は、組換えDNAバイオハザードの制度的手順に従って取り扱われるべきです
   手記：初代乳房細胞のレンチウイルス形質導入は、筋上皮細胞を強く支持するため、管腔細胞の標識が不十分になり、標識中に腫瘍細胞の亜集団が選択される可能性があります。
4. 形質導入の前に、ウイルスを200 mU/mlのノイラミニダーゼと37°Cで1時間インキュベートして、ウイルス粒子の異なる初代細胞亜集団への結合を増やし、この潜在的なバイアスを修正します。
5. PDX解離細胞がLin+マウス細胞から枯渇した場合、またはEpCam+細胞が濃縮されている場合は、10 MOI(2 x 10⁶ TU、2 x 10 6 TU)でレンチウイルス粒子を添加します。非濃縮PDX解離細胞を使用する場合は、30 MOI(2 x 10⁵生細胞に対して6 x 10 6 TU)でレンチウイルス粒子を添加します
   手記：MOIの増加により、粗抽出物中に大量の破片や死細胞が存在する場合でも、効率的な形質導入が可能になります。1つのウェルを標識されていない細胞で保持し、生存率と形質導入効率のコントロールとして機能します。
6. 渦巻き状に回転させてウイルスと細胞を混合します。37°C、5%CO₂で最大96時間インキュベートします。トランスフェクションの24時間後に、新鮮なマンモスフィア培地500 μlを添加します。細胞はプレートに付着せず、培地を吸引しません。

2. 免疫不全マウスにおける標識細胞の形質導入効率と再移植の評価

1. 蛍光顕微鏡を使用して24時間ごとにトレーサブルマーカー(GFP)の発現を10倍の倍率でモニターします.
   手記：GFPの発現は感染後24時間という早い時期に観察されますが、ほとんどのPDXでは、72時間後にGFPの発現がはっきりと見えます(図1)。
2. 全ウェル内のGFP+細胞の割合を評価することにより、形質導入の効率を推定します.
   手記：培養物には腫瘍細胞、残存間質細胞、および死細胞がさまざまな程度で含まれているため、GFP+細胞が10%程度のウェルを宿主マウスに移植できます。
3. 形質導入した細胞を6ウェルプレートから15 mLのコニカルチューブに移します。1 mLのマンモスフィア培地をウェルに加えて、残されたすべての細胞を収集します。氷の上に置きます。
4. 形質導入細胞にHBSS/hepes 10 mLを加え、300 x gで5分間、4 °Cで遠心分離します。上清を慎重に吸引し、氷上の50 μlのベースメントマトリックス抽出物(BME)に再懸濁します。
   手記：BMEアリコートは、使用の1〜2時間前に氷上で解凍する必要があります。BMEは室温で固化します。常に氷の上に置いてください。
5. BMEに包埋した細胞を0.5mlのインスリン注射器にロードし、氷上に保管し、動物施設に持ち込んでNSGマウスに再移植します。

結果

図1:解離PDX細胞における形質導入効率の追跡 A)ヒト上皮細胞用に濃縮されたPDX解離細胞(Lin+枯渇)を、pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviral particlesによる形質導入の24時間後に開始した。 B)別の実験で得られたPDX解離細胞、上皮細胞濃縮なし、pHAGE-EF1aL-ルシフェラーゼ-UBC-GFP-W形質導入後72時間。どちらのパネルにも生細胞が表示されます。BF:明視野画像、バーは50μmを表します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12 (1:1)	ハイクロン	01 SH30023日
bFGFの	BDバイオサイエンス	354060
EGFの	BDバイオサイエンス	354001
ヘパリン	シグマ	H4784-J
B27	Gibco/サーモフィッシャー	17504から44
抗真菌抗生物質	ハイクロン	SV30010
HBSSレッドCa2 + / Mg2 +フリー	ハイクロン	SH30031月02日
ヘペス
カルトレックス	カルトレックス	3433-005-01	地下マトリックス抽出物(BME)
30 °C シェーカー	ニューブランズウィックサイエンティフィック株式会社	シリーズ25インキュベーターシェーカー

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