BC細胞の共培養:がん細胞の増殖を研究するための骨片を用いた乳がん細胞の培養

要約

出典:Templeton, Z. S., et al. 転移ニッチの乳がん細胞コロニー形成を研究するためのヒト大腿骨組織外植片の培養方法. J. Vis. Exp (2015).

このビデオでは、大腿骨外植片に隣接する乳がん細胞を培養し、ヒト骨組織外植片モデルシステムにおけるがん細胞の増殖とコロニー形成を測定する方法を説明しています。

プロトコル

1. BLIを用いた骨片に隣接する乳がん細胞の共培養による乳房細胞の増殖測定

1. 実験に先立ち、2 x 10⁵ 乳がん細胞/50 μl を含む懸濁液を調製し、培養中の骨片を固定化するための骨ワックスのプラグを調製します。P200マイクロピペットの先端を3つに切り、最も大きい部分の狭い方の端を「クッキーカッター」のように使用して、小さな(~35 mg)骨ワックスをカットします。最小ピースの広い方の端を使用して、ボーンワックスプラグをペトリ皿に排出して保管します。
2. 各ウェルの12時位置に骨ワックスを置き、滅菌手袋をはめた人差し指で優しく押し下げます。
3. 6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10% FBS + Pen-Strepに1 x 10⁵個の乳がん細胞を含む細胞懸濁液50 μlをピペットで保存します。(あるいは、必要に応じて分散パターンで細胞を播種します。プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに45分間置き、細胞の接着を促進します。
4. 各実験ウェルの骨ワックス1枚に骨片1枚を載せ、ロンゲールで優しく圧力をかけて固定します。特定のTHR標本からの3つの骨片を上部の3つのウェルに配置し、下部の3つのウェルにはコントロールとしてのみ骨ワックスを含めるように、3回で実験を行います。
5. 5 mLのピペットを使用して、乳房細胞や骨片が剥がれないように、5 mLのDMEM-10% FBSを各ウェルの側面にゆっくりとゆっくりと送達します。プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに20〜24時間置きます。
6. 生物発光イメージング(BLI)を行うには、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルにルシフェリン基質(300 μg/mlの濃度を達成)を添加します。次のパラメータを使用して、IVISイメージングプラットフォームでプレートをすぐに画像化します:fストップ1、小さなビニング、1秒の露光時間、レベルD.各ウェルの信号強度を平均輝度(光子/秒/平方センチメートル/ステラジアン)として測定します。
7. イメージングソフトウェアを使用して関心領域(ROI)を定義し、すべての実験ウェルとコントロールウェルの平均輝度を定量化します。平均輝度値をExcelシートにエクスポートして、統計を実行し、グラフを生成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM (1倍) + GlutaMAX-l	ライフテクノロジー	〒10569-010	すべてのDMEMに10%ウシ胎児血清と1%ペン/溶連菌を補給
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	16000-044
ペニシレンストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
D-ルシフェリンホタル、カリウム塩5g(30mg / ml)	ライフテクノロジー	L-8220
6ウェルTC処理細胞培養クラスター	コーニングインコーポレイティッド	3516
フリードマン・ピアソン・ロンガー	ファインサイエンスツール	16021-14
ボーンワックス	サージカルスペシャリティーズコーポレーション	903
IVIS 50イメージングプラットフォーム	キャリパーライフサイエンス/パーキンエルマー
MCF-7乳がん細胞	ATCCの	HTB-22
MDA-MB-231乳がん細胞	ATCCの	HTB-26

します。 名 名