臓器馴化培地:転移性がん研究のための採取臓器細胞からの培地の生成

要約

出典:Piaseczny, M. M., et al. Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior. J. Vis. Exp.(2016).

このビデオでは、マウスの肝臓に由来する臓器馴染培地を生成する方法について説明しています。このモデル系は、臓器由来の可溶性因子と、それらががん細胞の臓器親和性および転移挙動に及ぼす影響を同定し、研究するために使用できます。

プロトコル

1. 肺と脳に条件付けられたメディアの生成

1. 無菌組織培養フードで、肺または脳を含むPBSチューブを3回反転させて臓器から残留血液を取り除き、血液を含むPBSを吸引します。溶液が血液の証拠なしに透明に見えるまで、新鮮な冷たいPBSで繰り返します。
2. 肺と脳を別々の60mm2ガラスシャーレに入れます。2枚の滅菌メスの刃を使用して、組織の断片が約~1mm3のサイズになるまで前後にスライスを繰り返して、肺または脳をミンチにします。
3. 計算された重量差から、組織片を再懸濁するために必要な培地の量を決定します.
   手記：肺組織と脳組織は、4:1の培地:組織比(vol / wt)で再懸濁することにより重量を正規化します。
4. 1倍濃縮マイトジェンサプリメントとペニシリン(50 μg/ml)/ストレプトマイシン(50 μg/ml)を添加したダルベッコ修正イーグルス培地(DMEM):F12培地の適切な量(ステップ1.3で以前に決定)で組織断片を再懸濁します。
5. 再懸濁した肺組織または脳組織の断片を6ウェルプレートの1ウェルに加えます。
6. 組織断片を培地で37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。インキュベーション後、各組織にコンディショニング培地を採取し、50 mLのコニカルチューブに3つの同等の容量の新鮮な培地を加えてさらに希釈します。
7. 各臓器の希釈した馴化培地中で1,000 x gを4°Cで15分間遠心分離し、大きな組織破片を除去します。培地上清を回収し、0.22 μmシリンジフィルターでろ過します。
8. マウス間のばらつきを説明するために、複数のマウスから各臓器(すなわち、肺と肺、脳と脳)からプールされた調整培地。コンディショニングされた培地は、使用するまで-80°Cで分注して保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x リン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023	無菌状態に保つ
60 mm2ガラスシャーレ	シグマ・アルドリッチ	CLS7016560	無菌状態に保つ
DMEM:F12	ライフテクノロジー	〒21331-020	使用前に37°Cの水浴で温め、無菌状態に保ちます
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	ライフテクノロジー	15140-122	無菌状態に保つ
50mlコニカルチューブ	Thermo Scientific(Nunc)	339652	無菌状態に保つ
0.22 μm シリンジフィルター	シグマ・アルドリッチ	Z359904	無菌状態に保つ
6ウェル組織培養プレート	Thermo Scientific(Nunc)	140675	無菌状態に保つ
メスの刃	フィッシャーサイエンティフィック	S95937A	無菌状態に保つ