インドインクの膨張:腫瘍結節を視覚化するための染色法

要約

出典:Paschall, A. V. et al. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、腫瘍を持つマウス肺の腫瘍結節を定量化するためのインディアインクインフレーション(染色法)について説明しています。染色後、肺をフェケテ溶液に固定して、肺の腫瘍結節を観察します。

プロトコル

1. India Ink Inflation of tumor-bearing Lungsを用いた肺転移の検証

>注:ルシフェラーゼの生腫瘍イメージング結果を検証するには、腫瘍形成マウス肺のインディアインク膨張を実施して腫瘍結節を定量化します。4T1細胞は他の臓器や組織にも転移するため(図1)、したがって、必要に応じて腫瘍転移を検証するためにこれらの臓器の組織学的検査を実施する必要があります。このプロトコルでは、例として肺転移を使用します。

1. 安楽死のためにマウスを既存の自宅ケージに入れてください。他の動物と一緒に飼育されている場合は、安楽死させられていないマウスを別のケージに移します。
2. ケージフィルタートップを取り外し、CO2フィルタートップと交換します。CO2フィルタートップに接続されている圧縮CO2ガスボンベ(100%)をオンにします。流量を2L/minに設定し、CO2を10分以上オンに保ちます。10分経過してもマウスが呼吸をしている場合は、マウスが呼吸を停止してから少なくとも1分後までCO2をオンのままにします。CO2ボンベ制御と流量計をオフにします。さらに3分待ってから、フィルタートップを取り外します。
3. 犠牲にされたネズミを背中にしてポリスチレンボードの上に置きます。脚を固定して、気管へのアクセスを妨げないようにします。マウスに70%エタノールをスプレーします。
4. はさみを使用して、マウスの中腹部の正中線に沿って胸郭を通って唾液腺に向かって切ります。気管を観察します。鉗子を使用して気管の周囲の組織を取り除き、気管を露出させます。
5. ピペットチップを気管の下に通します。片手で先端を持ち、気管をそっと持ち上げて体から離します。
6. マウスを持ってプラットフォームを180°回転させます。1/2 CC 27 G 1/2 ツベルクリン注射器を使用して、気管を介してインドインク(10%インドインクと0.1%水酸化アンモニウム)を肺に注入します。強い抵抗が感じられるまで、インクで肺を完全に膨らませます。
7. はさみを使って気管を切断します。鉗子を使用してマウスを保持し、別の鉗子のセットを肺の下に挿入し、マウスから肺葉を引き抜きます。水の入ったビーカーで肺を短時間すすいでください。
8. 化学フュームフードで、3 mlのフェケテ溶液(50%エタノール、6%ホルムアルデヒド、および3%氷酢酸)を含むガラスシンチレーションバイアルに肺を移します。溶液が蒸発するのを防ぐためにバイアルにキャップをします.
   手記：組織はフェケテの溶液に無期限に保存することができます。
9. 数分後、腫瘍結節が黒い肺に白い点として観察されます(図1)。白い腫瘍結節は目で見えます。肺をヒュームフード内の皿に移し、白い斑点の数を数えます。各白い斑点は、単一の転移性腫瘍結節を表します。

結果

図 1.インドインクインフレーションによる肺腫瘍結節の視覚化。腫瘍発生マウスの肺を墨汁で膨らませ、フェケテ溶液に固定した。白い点は肺転移です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
9 mm オートクリップアプライヤー	ベクトンディキンソンプライマリケア診断。スパークス、メリーランド州	427630
鋭利な解剖はさみ	漁夫	8940
細尖った鉗子の解剖	漁夫	8875
70%エタノール	Ultrapure-usa.com
1/2 CC 27 G 1/2 ツベルクリン注射器	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー・ニュージャージー州	305620

名