機械的解離:組織から生細胞を得る方法

要約

出典:Garaud et al., A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (2014).

このビデオでは、生細胞を得るための新鮮なヒト組織の非酵素的解離について説明しています。この技術は、さまざまな正常および悪性のヒト組織に存在するCD45陽性細胞(リンパ球/白血球)の定性的および定量的分析に使用されます。

プロトコル

1. 組織ホモジネートの調製

1. 解剖された組織(手術室から切除された悪性組織および正常組織)は、訓練を受けた担当者によって病理学研究室にあり、すぐにピックアップできます。腫瘍、NANT (腫瘍からできるだけ遠い距離で採取)、および正常組織の断片は、BSL2 ラボでの外科的切除から 1 〜 3 時間以内に、ヒト組織に対する標準的なバイオセーフティ手順を使用して日常的に処理されます。プロトコルのフローチャートを図1に示します。
2. すべての組織片(正常、NANT、腫瘍)を計量し、長さ、幅、高さ(長さ×幅×高さ)を測定します。これは、その後の細胞亜集団、抽出されたRNAなどの標準化のための重要なステップです<br /> 手記：サンプルサイズの範囲は100〜10,000 mm³で、可能であれば脂肪はありません。
3. H&E染色用のスライドガラスに腫瘍の断片を刻印し、組織が実際に腫瘍の一部であることを確認します。
   1. これを行うには、ガラス顕微鏡スライドを腫瘍片に押し付け、指で数秒間穏やかに圧力をかけます。
   2. スライドをイソプロパノールで2分間固定し、続いて水で洗浄します。組織をメイヤーヘマトキシリンで30秒間対比染色します。
   3. 滑り台を6つの水浴槽で洗います。フロキシンB 2%に15秒間染色します。
   4. 1つの水浴で洗い、続いてイソプロパノールを4浴し、1つの水で仕上げます。
   5. イソプロパノールで1分間インキュベートし、水気を切ります。キシレンの2つの浴槽でクリア。
   6. キシレンベースの封入剤でマウントします。腫瘍の細胞性を調べます(図2).
      手記：主に、腫瘍細胞は刷り込まれたスライドにくっつきます-間質細胞、リンパ球、または脂肪細胞が残ることはめったになく、腫瘍細胞の間にスペースが残ります(図2)。
4. 組織断片を、1 mLの既知組成の無血清造血細胞培地(以下、培地)を入れた小さな培養皿に室温で入れ、滅菌メスを使用して小片(~1 - 2 mm²)にダイスします。
5. すべてのもの(組織片+培地)を機械的な解離器Cチューブに移します。
6. パスツールピペットを使用してペトリ皿とメスを2mlの培地ですすぎ、これをCチューブ(解離用培地の容量= 3 ml)に加えます。
7. Cチューブ用の機械的解離プログラムA.01(最も穏やかなプログラム)を使用して、組織断片を単一細胞懸濁液に均質化します。Cチューブを装置にセットし、プログラムを2回連続して実行します(1サイクル= 25秒).
   手記：この均質化手順は、ヒトの乳房組織に対して確立および検証されていますが、他の腫瘍または組織タイプは別のプログラムを使用する必要がある場合があり、最初にテストする必要があります。
8. Cチューブを装置から取り外し、ホモジネートを50 mLチューブ上に装着した40 μmセルストレーナーに直接デカントします。ステップ1.6と同じパスツールピペットを使用して、Cチューブに残っている液体をセルストレーナーに移します。
9. ろ過した液体を1mlのマイクロピペットチップを使用して15mlのチューブに移します。セルストレーナーとその50mlチューブを一時的に保管します。
10. Cチューブを追加の3 mLの培地ですすぎ、ステップ1.6と同じパスツールピペットを使用して、これを50 mLチューブに装着したままの細胞ストレーナーに移します。均質化されていない組織に閉じ込められた残留液体を最大量50 mlチューブに絞り込み、清潔なパスツールピペットまたは溶出液の汚染を避けるために1 mlのチップを使用してストレーナーの周りを静かに動かします。
11. セルストレーナーを逆さまにして元のCチューブに置き、3 mLの培地ですすいで、均質化されていない組織がCチューブに戻るようにします。
12. A.01プログラムの2サイクルについて、ステップ1.7と同様に再均質化します。
13. この第2のホモジネートを50 mLチューブに装着したセルストレーナーに注ぎ、Cチューブを3 mLの培地で再度すすぎ(ステップ1.10と同様)、パスツールピペットで50 mLチューブに装着したセルストレーナーに再度移し、セルストレーナーに閉じ込められた残留結合組織から最大量の液体を絞ります。
14. この時点で、15 ml チューブには ~2.5 ml、50 ml チューブには ~9 ml の容量があります。

2. 上清組織と細胞の分離

1. 15 mLおよび50 mLチューブ内のホモジネートを室温で600 x gで15分間遠心分離します。
2. SNを15 mLチューブから清潔なチューブにデカントし、4°Cで仮保存します。この上清=原発腫瘍、NANTまたは正常組織SN(最終容量2.5 ml)は、その後、将来の分析のために-80°Cで保存する前に、明確にし、分注します(下記参照)。
3. 50mlチューブから上清を捨てます。
4. 両方の細胞ペレットを最終容量の1 mL培地に穏やかに再懸濁します。簡単に言うと、まず両方のチューブで細胞ペレットを静かに壊します(チューブを硬い表面に軽くたたいて)。ルースセルペレットを500 μlの培地で50 mLに再懸濁し、この細胞懸濁液を15 mLチューブに移して、2番目のペレットを再懸濁します。このステップを2回目の500 μlの培地で1回繰り返して、細胞の回収率を最大限に高めます。
5. 細胞懸濁液10 μlを小さなチューブに移し、トリパンブルー10 μl(希釈1:1)と混合し、血球計算盤を使用して生細胞の数をカウントします
   手記：この時点で、細胞懸濁液の一部をフローサイトメトリーで分析して、細胞サイズ、粒度を評価し、必要に応じて限られた数の亜集団マーカーを評価して、広範な分析または実験の前にホモジネート中の相対的な細胞分布をより正確に評価することもできます。フローサイトメトリーによるすべての解析には、亜集団の標準化のためのCD45標識が組み込まれています。
6. 細胞を300 x gで遠心分離し、室温で10分間ペレット化します。腫瘍、NANT、または正常組織からの細胞は、さらなる精製または分析の準備が整いました。これらの追加ステップは、手術と同じ日に行うのが最適です.
   手記：フローサイトメトリー解析では、細胞選別ではなく、抗体標識後に、細胞ペレットに0.4 mLの赤血球溶解バッファーを添加し、直ちに1秒間ボルテックスし、解析前に室温(光から保護されている)で最低10分間インキュベートすることにより、残留赤血球を溶解する必要があります。

3. 上清組織の明確化

1. 1.5 mLチューブを組織SNと共に15,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
2. ペレットに触れたり邪魔したりしないように、上清を慎重に取り除きます。必要なアリコートの数と量に応じて、きれいなチューブ(またはチューブ)に移します。
3. 上清は、将来の使用のために-80°Cで保存してください。

結果

図1:プロトコルのフローチャート。新鮮なヒト組織を処理するための手順と、その後ヒト組織に浸潤するリンパ球を評価するために使用できるいくつかの分析アプローチが示されています。

図2:乳房腫瘍組織インプリントのH&E染色画像。このインプリントは、新鮮な乳房腫瘍組織の断片から採取されたもので、腫瘍細胞の存在を示しており、オープンスペースには移されなかった領域が反映されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GentleMacsの解離者	ミルテニーバイオテック	〒130-093-235	BDメディマシンはある程度同等です
遠心分離機 5810 R	エッペンドルフ		またはその他の標準的なテーブルトップ遠心分離機
遠心分離機 5417 R	エッペンドルフ		またはその他の標準的な微量遠心分離機
Esco Class II A2バイオセーフティキャビネット	ESCOグローバル		またはその他の標準BSL2フード
倒立顕微鏡	ニコン エクリプス TS100		または血球計算盤に対応した他の顕微鏡
ビュルカーチェンバーマリエンフィールド		640210	または他の標準的な血球計算盤
Naviosフローサイトメーター	ベックマン・コールター		または他のフローサイトメーター(8-10色を推奨)
ジェントルマックCチューブ	ミルテニーバイオテック	〒130-096-344	BDメディマシンはFilconを使用しています
細胞培養ディッシュ	ザルシュテット	72,710	またはその他の非発熱性プラスチック製品
使い捨てメス	スワン・モートン	510	または標準的な使い捨て滅菌メス
BDセルストレーナー 40 μm	ベクトン・ディキンソン	〒734-0002	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BDファルコンチューブ50ml	ベクトン・ディキンソン	352070	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BDファルコンチューブ15 ml	ベクトン・ディキンソン	352097	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BD FACSチューブ5 ml	ベクトン・ディキンソン	352008	またはその他の非発熱性プラスチック製品
滅菌パスツールピペット5 ml	VWRの	〒612-1685	またはその他の非発熱性プラスチック製品
マイクロチューブ1.5 ml	エッペンドルフ	7805から00	またはその他の非発熱性プラスチック製品
X-Vivo 20 (エックスビボ 20	ロンザ	BE04-448Q	無血清培地推奨
リン酸緩衝生理食塩水	ロンザ	BE17-516F	標準的な生理学的PBS
トリパンブルー	VWRの	17942E	またはその他の重要な汚れ

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