軟寒天コロニー形成アッセイ:癌細胞増殖に対する新規化合物の影響をテストする方法

要約

出典:Horibata A. et al., Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、PADI酵素阻害剤とBB-Cl-アミジンがin vitroで乳がんの腫瘍形成に及ぼす影響をテストするための柔らかい寒天コロニー形成アッセイについて説明しています。また、このアッセイは、遺伝的摂動の文脈における細胞形質転換の可能性を定量的に評価することを可能にします。

プロトコル

1. 3% 2-ヒドロキシエチルアガロースの調製

1. 清潔で乾燥した100 mlのガラス瓶に、0.9 gの2-ヒドロキシエチルアガロース(アガロースVII)を加え、続いて30 mlの蒸留水を加えます。.
2. 混合物を電子レンジで15秒間加熱し、静かに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を少なくともさらに3回繰り返します。
3. 溶液含有ボトルを15分間オートクレーブします。
4. アガロース溶液をRTまで冷ましてから使用してください。ソリューションを RT に保存します。

2.最下層の調製:0.6%アガロースゲル

1. 5 mLおよび10 mLのピペット数本を37 °Cのインキュベーターで予温し、取り扱い時にアガロースがピペット内で固まらないようにします。
2. ボトルの蓋を部分的に緩め、既製の3%2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を電子レンジで15秒間加熱します。次に、溶液を静かに渦巻き、さらに15秒間電子レンジで加熱します
   注意：アガロース溶液を渦巻くときは、空気にさらされると溶液が浮き上がり、こぼれる可能性があるため、注意してください。
3. ボトルに固体ゲルが残っている場合は、さらに数秒間電子レンジで加熱します。
4. 次のステップでは、アガロース溶液が入ったボトルを45°Cのウォーターバスに保管して、アガロース溶液が早期に固まるのを防ぎます。
5. 37°Cのウォーターバスで温MCF10DCIS培地.
   手記：MCF10DCIS培地は、DMEM/F12、5% ウマ血清、5% ペニシリン ストレプトマイシンで構成されています。
6. 予熱したピペットを使用して、3 mlの3 mlを滅菌済みの50 mlコニカルチューブに移します。
7. すぐに12mlの温かいMCF10DCIS培地を加え、円錐形のチューブを静かに反転させてアガロースを培地と混合します。泡は後でコロニーのカウントに支障
をきたすため、形成しないようにしてください。
8. この混合物を2 mLを6ウェル培養プレートの各ウェルに、気泡を形成せずに穏やかに加えます。
9. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に1時間インキュベートし、混合物が固化するまで待ちます。
10. 混合物が固まったら、プレートを37°Cのインキュベーターに30分間入れます。これで、最下層を使用する準備が整いました。

3. 細胞含有層の調製:0.3%アガロースゲル

1. MCF10DCIS細胞をトリプシン化し、細胞濃度4 x 10⁴ / mlに希釈します。
2. 予熱したピペットを使用して3%アガロース2 mLを取り、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。
3. すぐに8 mlのMCF10DCIS培地を円錐管に加え、穏やかに反転させてアガロースを培地と混合します。気泡の形成は避けてください。
4. MCF10DCIS細胞2ml(4 x 10⁴ / ml)を取り、BB-CLA(0μM(DMSO)または1μM)で処理します。
5. 1:1の希釈で、細胞を0.6%アガロースと混合します。
6. 細胞-アガロース混合物1 mLを取り、6ウェル培養プレート(2 x 10⁴細胞/ml)の最下層に穏やかに加えます。
7. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に少なくとも15分間置き、最上層が固化するまで待ちます。
8. 混合物が固まったら、プレートを37°Cのインキュベーターに1週間入れてから、供給層を追加します。

4.フィーダー層の調製:0.3%アガロースゲル

1. 既製の3%2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を15秒間電子レンジで加熱し、溶液を静かに渦巻き、さらに15秒間電子レンジで加熱します。
2. アガロース溶液ボトルを45°Cの水浴で平衡化します。
3. MCF10DCIS培地を37°Cのウォーターバスで温めます。
4. 1 mLの3%アガロース溶液と9 mLの温かいMCF10DCIS培地を50 mLのコニカルチューブに混合し、静かに反転させてアガロースを培地と混合します。気泡の形成を避けてください。
5. 混合物をBB-CLA(0 μM(DMSO)または1 μM)で処理します。
6. この混合物1 mLを(気泡を形成せずに)底部と軟層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに穏やかに加えます。
7. 6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に少なくとも15分間置き、混合物を固化させます。
8. フィーダー層が固まったら、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。
9. この給餌手順を毎週繰り返し、1 mLの0.3%アガロース/培地/処理溶液を既存のフィーダー層に重ねて、コロニー形成が観察されるまで細胞に新しい培地を補充します
   手記：軟質層とフィーダー層の寒天は非常に柔らかいため、フィーダー層から追加された栄養素は、細胞含有層に容易に拡散して細胞に到達します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ツァイスアクシオポット	カールツァイス顕微鏡	1021859251
倒立顕微鏡	オリンポス	CKX41
DMEM/F-12	ロンザ・ビオウィテカー	12-719F
ハイクローン ドナー ウマ血清	フィッシャーサイエンティフィック	03 SH30074日
ペニシリンストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
2-ヒドロキシエチルアガロース:VII型、低ゲル化温度	シグマ・アルドリッチ	39346-81-1