尾静脈注射:マウスモデルにおける転移研究のためのがん細胞投与法

要約

出典:Warren et al., Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (2019).

この動画では、尾静脈注射を用いて標識がん細胞をマウスモデルに注入する技術について説明しています。さらに、乳がんの転移、形成、成長を、リアルタイムの生体内生体動物イメージングを用いてモニタリングします。

プロトコル

1. 標識がん細胞の尾静脈注射

>注:ステップ1.2.4は、同系BALB/cマウスで増殖する4T1細胞に最適化されています。他のがん細胞株やマウス株を使用する場合は、まず注入する細胞の数とアッセイの長さを最適化する必要があります。

1. ステップ2で作製した4T1細胞株を、2つの15 cmディッシュで完全増殖培地に増殖させ、注射当日に余分な細胞が利用できるようにします。
2. 次のように尾静脈注射用の細胞を準備します。
   1. 培地を吸引し、細胞プレートを1x PBSですすいでください。
   2. 15 cmプレートあたり5 mLのトリプシンで細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞はウェルの底を自由に洗い流す必要があります)。すべての細胞を円錐形のチューブに移します。トリプシンを急冷するのに十分な完全増殖培地で組織培養皿から残りの細胞を洗い、同じ円錐管に洗浄液を加えます。
   3. 自動セルカウンターを使用してセルをカウントし、合計セル数を決定します。
   4. 細胞を122 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を1x PBSに所望の濃度で再懸濁します。ここでは、2.5 x 10⁴細胞を100 μLのPBS中に各マウスに注入するため、細胞は2.5 x 10⁵細胞/mLで再懸濁されます。細胞懸濁液を注射まで氷上に保ちます.
      注:細胞のトリプシン化と尾静脈注射の間の時間を約1時間に制限することが重要です。
3. ステップ1.2.5の4T1細胞を、次のように外側尾静脈を介してマウスに注入します。
   1. 動物施設のフード内で作業し、チューブを反転させるか、1mLの注射器を使用して細胞を穏やかに、しかし完全に混合して、細胞が均一に再懸濁されるようにします。シリンジをロードする前に、必ずセルが再懸濁されていることを確認してください。
   2. 1 mLのルアーロックシリンジに細胞懸濁液をロードし、余分な気泡を排出します。1/2インチ、30ゲージの針をシリンジに置き、ベベルを上にして気泡を排出します。
   3. マウスをげっ歯類の拘束具にそっと置きます。
   4. 尾外側の静脈が見え、拡張している必要があります。そうでない場合は、尾の付け根をそっとつまみ、尾を温かい水道水に浸して静脈を拡張します
      手記：静脈の拡張は、マウスケージを加熱ランプの下および/または加熱パッドの上に置くことによっても達成され得る。
   5. アルコールワイプを使用してテールを清掃します。針を尾静脈に挿入し、斜角を上にして、細胞懸濁液100μLを注入します><。 手記：針が静脈に適切に挿入されていれば、針はわずかに前後に滑りやすく、プランジャーを押すときに抵抗がないはずです。また、注射が成功すると、注射後数秒間、静脈の青色が白くなる「フラッシュ」が発生するはずです。
4. ゆっくりと針を取り外し、滅菌ガーゼを使用して、注射部位に圧力を加えて出血を止めます。
5. マウスをケージに戻し、15分間監視して、完全に回復することを確認します。マウスは、痛みや苦痛の兆候がないか週に3回チェックする必要があります。
6. in vivo生きた動物イメージングデバイスを使用して、マウスの転移形成と増殖を3〜6週間(細胞株およびマウス系統に依存)監視します(ステップ1.5および1.6を参照)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.5%トリプシン	ギブコ	15090-046	組織培養用トリプシン
アルコールワイプ			尾静脈注入前の注射部位のステロール化に
BALB/Cマウス(雌、6週間)	タコニック	バルブ-F	尾静脈転移性コロニー形成および負荷アッセイ
ダルベッコ&39;S リン酸緩衝生理食塩水	ハイメディア	TS1006
EDTAの	VWRの	97061-406	組織培養用のトリプシンを希釈するために使用されます
FBS 100%米国発	VWRの	〒97068-085	完全な成長培地の構成要素
L-グルタミン	ギブコ	〒25030-081	完全な成長培地の構成要素
マウス乳がん細胞、4T1	カルマノスがん研究所	Aslakson, CJ et al.,1992	マウス転移性乳房カンス細胞株
ペニシリンストレプトマイシン	ギブコ	15140-122	完全な成長培地の構成要素

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