CTC免疫蛍光アッセイ:循環腫瘍細胞の特性評価技術

要約

出典:Garcia, J., et al.免疫蛍光法による非小細胞肺がん患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性評価と列挙。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、非小細胞肺がん患者サンプル中の循環腫瘍細胞上のバイオマーカーを特徴付ける技術であるCirculating Tumor Cells(CTC)免疫蛍光アッセイについて説明しています。このアッセイは、腫瘍の動的変化と免疫応答のモニタリングに使用でき、これは化学療法、放射線療法、および可能な免疫療法治療に対する反応を反映している可能性があります。

プロトコル

1. 免疫蛍光染色

1. 血球計算盤タイプのグリッドを備えたチャンバースライド上に、mLあたりの細胞数を列挙します。濃縮したサンプルを0.2%抗結合溶液(材料表)で希釈し、細胞スピンあたり100,000細胞/100μLに達する濃度にします。
2. 綿(Table of Materials)を使用して、サンプルチャンバーの輪郭を湿らせ、50 μLの0.2%結合防止溶液を加えます。ポリリジンスライドガラスをサンプルチャンバーに置き、閉じます。
3. チップを0.2%結合防止液で3回ピペッティングしてコーティングし、濃縮したサンプルを再懸濁し、細胞溶液をサンプルチャンバーに移します。専用の遠心分離機(Table of Materials)で400rpmで4分間遠心分離します(加速は低い)。
4. 堆積領域の周囲にシリコンアイソレータを配置します。スライドガラスを微生物学的安全キャビネットの下で2分間乾燥させます。
5. 1 mL の 16% パラホルムアルデヒド(PFA)を 3 mL の滅菌 PBS で希釈して、固定溶液を調製します。サンプルあたり100 μLの固定溶液(4% PFA)を添加し、室温で10分間インキュベートします。固定液を取り出し、200 μLのPBSで3回洗浄し、室温でそれぞれ2分間インキュベートします
   注意: PFAは、吸入を防ぐために化学安全キャビネットの下に使用してください。
6. ウシ胎児血清(FBS)を5%、Fc受容体(FcR)ブロッキング試薬を5%、ウシ血清アルブミン(BSA)を1%で無菌PBSに希釈することにより、飽和溶液を調製します(Table of Materials)。サンプルあたり100 μLの飽和溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。
7. サンプルあたり100 μLの抗体溶液を添加します(CD45抗体1/20;PanCK抗体1/500;PD-L1抗体1/200;Qsp 飽和溶液 100 μL) (材料表)。ポリリジンスライドガラスを100 mm x 15 mmのシャーレに入れます。吸収紙を2mLの滅菌水で湿らせ、蓋をしてシャーレを閉じます。4°Cで一晩置き、光から保護してください。
8. 抗体ミックスを取り出し、200 μLのPBSで3回の洗浄を行い、各洗浄で2分間インキュベートします。サンプルを5分間乾燥させ、光から保護します。10μLの埋込液(材料表)を成膜領域に置き、気泡を作らないように顕微鏡カバースリップで覆います。カバースリップをマニキュアで密封します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プルロニック F-68 10%	ギブコ	〒24040-032	結合防止ソリューション。保存条件:常温
EZサイトファンネル	サーモフィッシャー	A78710003	綿のサンプルチャンバー。保存条件:常温
Shandon Cytopsin4 遠心分離機	サーモフィッシャー	A78300003	専用の遠心分離機。保存条件:常温
パラホルムアルデヒド 16%	サーモフィッシャー	11490570	固定ソリューション。保管条件:+4°C
リン酸緩衝生理食塩水超高純度グレード1X – 1L	第1基地研究所	BUF-2040-1X1L	保存条件:常温
FcRブロッキング剤	ミルテニーバイオテック	〒130-059-901	保管条件:+4°C
PD-L1モノクローナル抗体 (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	バイオレジェンド	BLE329706	保管条件:+4°C
PanCKモノクローナル抗体 (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	サーモフィッシャー	53-9003-80	保管条件:+4°C
CD45モノクローナル抗体(クローンHI30) Alexa Fluor 647	バイオレジェンド	BLE304020	保管条件:+4°C
フルオロマウント	シグマ	F4680	取り付けソリューション。保存条件:常温
ペトリ皿	ダッチャー	632180	保存条件:常温
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	オザイム	BE17-512F	保管条件:+4°C
ポリリジンスライド	サーモフィッシャー	J2800AMNZ	保存条件:常温
シリコンアイソレータ	グレースバイオラボ	664270	保存条件:常温
滅菌脱イオン水 – 100 mL	第1基地研究所	CUS-4100-100ミリリットル	保存条件:常温
子牛胎児血清(FCS)	ギブコ	10270-106	保管条件:+4°C